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[交流]
关于DGGE，请各位指教了
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各位大哥，大姐： 大家好，小妹最近一直做DGGE碰到问题了，需要大家的指教：我是做动物肠道微生物的，其中PCR程序是：试剂 • 10 PCR buffer (Roche) 5.0 l • 10 mM dNTPs 1.0 l • primer 1 (Forward, 10 pmol / l) 2.5 l • primer 2 (Reverse, 10 pmol / l) 2.5 l • Dimethylsulfoxide (DMSO; 4%) (v/v) 2.0 l • Taq Polymerase ( 1 units/l ) (Roche) 1 l • DNA (100 diluted, 5 l in 495 l water) 1.0 l • Sterile water (use for PCR only) 35 l • Mg2+ 3ul 操作步骤： 1 94℃，4min； 2 94℃，30s； 3 56℃，30s； 4 72℃，2min； 5 GOTO 2 REP 29； 6 72℃，10min； 7 4℃， forever； 8 End DGGE使用的是35%-65%的变性胶，1*TAE缓冲液，60℃，100V，跑16-18个小时，以下是胶的配制： 组分 35 % 变性液 (LOW) 65% 变性液(HIGH) 50 X TAE 缓冲溶液 300 l 300 l 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 3.75 ml 3.75 ml 去离子甲酰胺 2.1 ml 3.9 ml 尿素 2.205 g 4.095 g DCode 染料 0 l 150 l 10 % (w/v) 过硫酸铵 150 l 150 l TEMED 15 l 15 l 灭菌双蒸水 To 15 ml To 15 ml 使用快速银染法： 双蒸水漂洗两次，0.2%AgNO3染1小时，双蒸水漂洗两次，显影液显影30min，双蒸水漂洗两次，照相。 图一 PCR产物跑琼脂糖电泳 （2%琼脂糖） 图一 PCR产物跑琼脂糖电泳 （重新PCR） 图三 图一的PCR产物跑的DGGE结果 其中第一张图看起来PCR扩增条带还很亮，但是DGGE结果（图三）就只有marker出现隐约的几条带，而且还很歪，其他的都没有条带出现，重新扩增以后，跑琼脂糖电泳（2%的琼脂糖）（图二），PCR产物条带都很淡，别人说是引物二聚体，就没接着做DGGE了。 请各位高手指点啊，谢谢了。 |
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