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[求助]
DNA克隆
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求助啊，我克隆了一个基因，当时先是克隆ORF区片段，然后做3'和5'的克隆，在NCBI上比对也是对的。最后克隆出全长序列。 第二步进行这个基因的成熟肽克隆。按道理来说，我克隆成熟肽的引物是完全互补的，只是特异性不高，但是降低温度和升高温度进行了梯度PCR，最后有相似条带，但是测序都不对，这是什么原因啊？而且我从头来做，从第一步的ORF区的片段现在重新来克隆，又不出条带了？这是什么原因？ |
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