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guoqin_shiyin银虫 (正式写手)
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[交流]
关于克隆的几个小小疑问请高手看看
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有几个小疑问想请教高手， 第一，氯化钙做好的感受态可以放在零下20度保存多久其转化效率不受影响呢？ 第二，酶切后做完连接剩下的的质粒和片段可以在－20度保存吗？以后再用来做连接还可以吗？ 第三，听说TSS制备感受态细胞效果挺好，请问有达人做过吗？效果真的比氯化钙要好吗？ 第四，在连接的时候10微升体系里面，一般加1微升的酶，请问如果多加一点比如2微升的连接酶，连接效率会提高吗？ 第五，我有好几次做克隆后用提取的质粒做模板能够扩增出自己插进去的片段，比如说我要把GMP插入质粒，转化后的重组质粒我可以扩出GMP，或者可以扩出p,但是整体的就是以前载体上有的和GMP一起扩却无法扩增出来，比如GMPNA就无法扩增，请问这是为什么啊？ 请高人指点，有金币送哦，谢谢 |
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4楼2008-04-02 11:54:38
2楼2008-04-02 09:02:24
skkyy88888
铜虫 (著名写手)
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 142
- 散金: 1521
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- 虫号: 277762
- 注册: 2006-09-09
- 专业: 生物化学
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第一，氯化钙做好的感受态可以放在零下20度保存多久其转化效率不受影响呢？ 最多一个礼拜 第二，酶切后做完连接剩下的的质粒和片段可以在－20度保存吗？以后再用来做连接还可以吗？ 可以 第三，听说TSS制备感受态细胞效果挺好，请问有达人做过吗？效果真的比氯化钙要好吗？ 用ＫＭＥＳ要更好，ＤＥＰＣ多抗冻寄 第四，在连接的时候10微升体系里面，一般加1微升的酶，请问如果多加一点比如2微升的连接酶，连接效率会提高吗？ 一般１就足够 第五，我有好几次做克隆后用提取的质粒做模板能够扩增出自己插进去的片段，比如说我要把GMP插入质粒，转化后的重组质粒我可以扩出GMP，或者可以扩出p,但是整体的就是以前载体上有的和GMP一起扩却无法扩增出来，比如GMPNA就无法扩增，请问这是为什么啊？ ＰＣＲ条件要好好摸索，跟摸版有关系拉 |
3楼2008-04-02 11:48:20
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guoqin_shiyin(金币+1,VIP+0):thank
guoqin_shiyin(金币+1,VIP+0):thank
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1：感受态制备的方法中：CaCl2-MgCl2法的效果很好，其优点在于：转化效率高（假 阳性克隆少）；转化后得到的克隆个大、饱满（很讨人喜欢哦） 2：感受态制备好后，在两天内用不完的需立即用液氮冻存于-70度中，半年到一年的时间都可以用，只是随着冻存时间的延长，转化效率也会下降的。 3：酶切后做完连接剩下的的质粒和片段可以在－20度保存，放置7-8个月不会有问题（经个人实践检验） 4：连接时，根据试剂盒说明书做，最好的方法步骤、建议都在里面，要用心阅读，并按照说明做；另外，10uL的体系连接不出来时，可以用20uL的连接体系，把体系放大即可；但是，请注意，不是体系大了就好，感受态转化会对DNA的含量有要求。还是那句话，仔细研究说明书，那是最好的教材啦 祝你好运，呵呵，连接与运气还是有点关系的！ |
5楼2008-04-02 12:38:28