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phage368

新虫 (初入文坛)

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专业: 微生物学

[交流] 今天首次进入小木虫,拿出些东西和大家分享一下!

植物蛋白质提取方法总汇
一、植物组织蛋白质提取方法

　　1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。

　　2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4小时）。

　　3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃

　　4、提取上清液，样品制备完成。

　　蛋白质提取液：300ml

　　1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml

　　2、甘油（Glycerol）75ml

　　3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g

　　这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！　　

　　二、植物组织蛋白质提取方法

　　氯醋酸—丙酮沉淀法

　　1、在液氮中研磨叶片

　　2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。

　　3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。

　　4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。

　　5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。

　　药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。

　　这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！　　

　　三、组织：肠黏膜

　　目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达

　　应用TRIPURE提取蛋白质步骤：

　　含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）

　　倒转混匀，置室温10min

　　离心：12000 g，10min，4度，弃上清

　　加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE用量）

　　振荡，置室温20min

　　离心： 7500g，5 min，4度，弃上清

　　重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2次

　　恋碇屑尤?00％乙醇 2ml

　　充分振荡混匀，置室温20 min

　　离心： 7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀

　　1％SDS溶解沉淀

　　离心：10000g，10min，4度

　　取上清-20度保存（或可直接用于WESTERN BLOT）

　　存在的问题：加入1％SDS后沉淀不溶解，还是很大的一块，4度离心后又多了白色沉定，SDS结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。

　　解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10分钟，效果很好的。　　

　　四、植物材料：水稻苗，叶鞘，根

　　1、200毫克样品置于冰上磨碎

　　2、加lysis buffer，离心，10000rpm，4度，5min取上清

　　3、重复离心5min

　　lysis buffer：urea np-40 ampholine 2-me pvp-40　　

　　五、蛋白质样品制备

　　秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等（1986）的方法进行。

　　100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配制，含10mM即0.07%β-巯基乙醇），混匀，-20℃沉淀1小时，4℃，15000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇)，再于-20℃沉淀1小时，同上离心弃上清，（有必要再用80％丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。

　　按每mg干粉加入20μl（可调） UKS液[9.5 M尿素，5mM碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫苏糖醇)，2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10)，6% Triton X-100]，37℃温育30min，期间搅动几次，28度（温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰）16000 r/min离心15 min，离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。或者-70度保存。　　

六、植物根中蛋白质的抽取

　　(1) sample, 液氮研磨

　　(2) 装1.5 ml centrifuge 用tube

　　(3) 加 1M KH2PO4 K2HPO4 700 ul

　　(4) 12000 rpm, 4度, 10-15minite

　　(5) 取上层液，蛋白质就在里面

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