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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » PCR产物 进行 酶切
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永峰1230

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-05 09:44:27
1.质粒和PCR产物当然是分别酶切了，分别切都不一定能切完全呢，你混一起那不是更麻烦，酶连的时候怎么定量？
问题不大，只要不再反复冻融就好，自然越早纯化越好。PCR产物在4度下放3天再检测就已经不那么亮了。1个 ...

产物 酶切 如何 确定 酶切好了呢 ？？  还是用  ：  酶切 质粒 去 确定酶切条件  ，然后 用这个 条件 酶切产物呢？谢谢谢谢
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12
11楼2014-06-13 15:12:05
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永峰1230

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by hailunl at 2014-06-06 20:18:35
如果载体构建，最好割胶回收。割胶回收更纯。
载体和产物不能一起酶切。

如何 确定 酶切 好了呢？　保护碱基　只有那么一点点，，电泳　可以　看出吗？　　　还是　先　酶切质粒　确定好条件，用这个条件　来　酶切ＰＣＲ产物呢？？？
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12
12楼2014-06-13 15:13:29
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luwei13566

木虫 (正式写手)
★
永峰1230(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-13 19:27:41
引用回帖:
11楼: Originally posted by 永峰1230 at 2014-06-13 15:12:05
产物 酶切 如何 确定 酶切好了呢 ？？  还是用  ：  酶切 质粒 去 确定酶切条件  ，然后 用这个 条件 酶切产物呢？谢谢谢谢...

分别酶切：基因+酶+buffer+水切割后纯化，载体+酶+buffer+水切割后纯化，回收好后基因+载体+连接酶+buffer连接。最后感受态细胞+连接液转化。至于酶切酶连体系你多看看内切酶和连接酶的说明书。做实验前多和实验室的师兄师姐交流交流，别自己闷头做。
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永峰1230
大家相互帮助哈
13楼2014-06-13 17:10:57
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永峰1230

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-13 17:10:57
分别酶切：基因+酶+buffer+水切割后纯化，载体+酶+buffer+水切割后纯化，回收好后基因+载体+连接酶+buffer连接。最后感受态细胞+连接液转化。至于酶切酶连体系你多看看内切酶和连接酶的说明书。做实验前多和实验室 ...

谢谢你 ，，
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12
14楼2014-06-13 20:15:56
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hailunl

金虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 永峰1230 at 2014-06-13 15:13:29
如何 确定 酶切 好了呢？　保护碱基　只有那么一点点，，电泳　可以　看出吗？　　　还是　先　酶切质粒　确定好条件，用这个条件　来　酶切ＰＣＲ产物呢？？？...

电泳无法检测加保护碱基的条带酶切好了与否。
质粒比PCR产物容易酶切。如果用快酶的，说明书提示5分钟可以切开，那么PCR产物最好酶切45~60min；如果用NEB酶，过夜酶切，可以保证产物完全切开。
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15楼2014-06-13 21:41:58
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永峰1230

铜虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-03 23:30:27
PCR条带单一就适合用产物纯化试剂盒纯化。
LZ说的和质粒一起酶切不会是质粒和PCR产物混合到一起进行酶切的意思吧。。。

请问，  割胶回收  能够去除  DMSO 吗？
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12
16楼2014-06-23 11:16:01
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永峰1230

铜虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
13楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-13 17:10:57
分别酶切：基因+酶+buffer+水切割后纯化，载体+酶+buffer+水切割后纯化，回收好后基因+载体+连接酶+buffer连接。最后感受态细胞+连接液转化。至于酶切酶连体系你多看看内切酶和连接酶的说明书。做实验前多和实验室 ...

请问，，割胶回收   ，可以 去除 DMSO 吗，，或者 甘油 可以去除的吧
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17楼2014-06-23 11:16:47
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 永峰1230 at 2014-06-23 11:16:47
请问，，割胶回收   ，可以 去除 DMSO 吗，，或者 甘油 可以去除的吧...

在跑电泳的时候这些试剂都差不多除掉了
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大家相互帮助哈
18楼2014-06-23 22:23:40
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