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永峰1230

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-05 09:44:27
1.质粒和PCR产物当然是分别酶切了,分别切都不一定能切完全呢,你混一起那不是更麻烦,酶连的时候怎么定量?
问题不大,只要不再反复冻融就好,自然越早纯化越好。PCR产物在4度下放3天再检测就已经不那么亮了。1个 ...

产物 酶切 如何 确定 酶切好了呢 ??  还是用  :  酶切 质粒 去 确定酶切条件  ,然后 用这个 条件 酶切产物呢?谢谢谢谢
12
11楼2014-06-13 15:12:05
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永峰1230

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by hailunl at 2014-06-06 20:18:35
如果载体构建,最好割胶回收。割胶回收更纯。
载体和产物不能一起酶切。

如何 确定 酶切 好了呢? 保护碱基 只有那么一点点,,电泳 可以 看出吗?   还是 先 酶切质粒 确定好条件,用这个条件 来 酶切PCR产物呢???
12
12楼2014-06-13 15:13:29
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luwei13566

木虫 (正式写手)


永峰1230(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-13 19:27:41
引用回帖:
11楼: Originally posted by 永峰1230 at 2014-06-13 15:12:05
产物 酶切 如何 确定 酶切好了呢 ??  还是用  :  酶切 质粒 去 确定酶切条件  ,然后 用这个 条件 酶切产物呢?谢谢谢谢...

分别酶切:基因+酶+buffer+水切割后纯化,载体+酶+buffer+水切割后纯化,回收好后基因+载体+连接酶+buffer连接。最后感受态细胞+连接液转化。至于酶切酶连体系你多看看内切酶和连接酶的说明书。做实验前多和实验室的师兄师姐交流交流,别自己闷头做。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

大家相互帮助哈
13楼2014-06-13 17:10:57
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永峰1230

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
13楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-13 17:10:57
分别酶切:基因+酶+buffer+水切割后纯化,载体+酶+buffer+水切割后纯化,回收好后基因+载体+连接酶+buffer连接。最后感受态细胞+连接液转化。至于酶切酶连体系你多看看内切酶和连接酶的说明书。做实验前多和实验室 ...

谢谢你 ,,
12
14楼2014-06-13 20:15:56
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hailunl

金虫 (正式写手)

引用回帖:
12楼: Originally posted by 永峰1230 at 2014-06-13 15:13:29
如何 确定 酶切 好了呢? 保护碱基 只有那么一点点,,电泳 可以 看出吗?   还是 先 酶切质粒 确定好条件,用这个条件 来 酶切PCR产物呢???...

电泳无法检测加保护碱基的条带酶切好了与否。
质粒比PCR产物容易酶切。如果用快酶的,说明书提示5分钟可以切开,那么PCR产物最好酶切45~60min;如果用NEB酶,过夜酶切,可以保证产物完全切开。
15楼2014-06-13 21:41:58
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永峰1230

铜虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-03 23:30:27
PCR条带单一就适合用产物纯化试剂盒纯化。
LZ说的和质粒一起酶切不会是质粒和PCR产物混合到一起进行酶切的意思吧。。。

请问,  割胶回收  能够去除  DMSO 吗?
12
16楼2014-06-23 11:16:01
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永峰1230

铜虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
13楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-13 17:10:57
分别酶切:基因+酶+buffer+水切割后纯化,载体+酶+buffer+水切割后纯化,回收好后基因+载体+连接酶+buffer连接。最后感受态细胞+连接液转化。至于酶切酶连体系你多看看内切酶和连接酶的说明书。做实验前多和实验室 ...

请问,,割胶回收   ,可以 去除 DMSO 吗,,或者 甘油 可以去除的吧
12
17楼2014-06-23 11:16:47
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luwei13566

木虫 (正式写手)

引用回帖:
17楼: Originally posted by 永峰1230 at 2014-06-23 11:16:47
请问,,割胶回收   ,可以 去除 DMSO 吗,,或者 甘油 可以去除的吧...

在跑电泳的时候这些试剂都差不多除掉了
大家相互帮助哈
18楼2014-06-23 22:23:40
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