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lx830618

金虫 (正式写手)

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[交流] 酵母表达

酵母表达：
引物设计：YzenF gTA Ggt acc TAC GTA ATG GCC CAG GTG AAA CTG CAA
      在SnaB1后直接连接自己的基因

电转化酵母GS115有转化子
PCR鉴定MD平板上的转化子：
用5’AOX，3’AOX和基因内部的引物分别鉴定（我的目的序列的大小2.2kb左右），
结果1 部分转化子用5’AOX，3’AOX引物扩增有2.2kb和2.6kb的条带，但用基因内部的引物扩增只有2.2kb条带——Mut+
   2  部分转化子用5’AOX，3’AOX和基因内部的引物扩增只有2.2kb条带——Muts
分别按下面的方法表达：
问题：1 在BMGY培养时为什么怎么也长不到OD600=2-6
      2 表达后上清用TCA沉淀有跑SDS-PAGE样品的泳道有很多蛋白的条带，而对照GS115和9K的上清条带很少。
      3 做WB没有条带
我的蛋白是不是没有表达呀？
Mut+胞内或分泌表达：为检测表达条件是否有效，亲代载体转化GS115作为胞内表达背景对照。
① 在筛选的阳性克隆进行诱导,挑取单克隆30℃在YPD中培养过夜，
② 按1%接种量接种至15mlBMGY中，(250ml摇瓶)，28-30度，250-300rpm摇至OD600=2-6(对数生长，大约16-18 小时)
③ 室温1500-3000g 离心5min，收集细胞，去除上清，用BMMY 重悬细胞至OD600=1.0，进行诱导表达(大约100-200ml)
3 在500ml摇瓶中加入上述培养物，加盖6层灭菌纱布，放入摇床继续生长。
4 每24 小时，加甲醇至终浓度为0.5%以继续诱导。检查培养基的量，确保正确加入甲醇，因为蒸发作用会减少培养基的体积。
Muts胞内或分泌表达
1 挑取单克隆，接种至含100mlMGY，BMG 或BMGY 的1L隔板摇瓶中。在摇床中28-30
度，250-300rpm生长至OD600=2-6(约16-18 小时)
2 室温1500-3000g 离心5min收集细胞，去除上清，用1/5-1/10 原培养基体积的重悬细胞(约10-20ml)
3 置于500ml 隔板摇瓶中，用6层灭菌纱布瓶口，放入摇床继续培养。
4 每隔24 小时，加入甲醇至终浓度为0.5%以继续诱导。

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