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挥汗如雨

至尊木虫 (职业作家)

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[交流] Southern杂交（地高辛法）背景很高很难看怎么办？

最近采用地高辛标记和检测试剂盒（DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ）做Southern杂交背景总是很难看(之前做点杂交也是如此问题,见下图)，请各位战友帮忙看看可能是什么原因造成这样的结果？如何改进？先谢谢大家的帮助！

我的杂交方法：
1 杂交探针的制备
⑴  PCR扩增
目的基因的引物序列、PCR扩增反应条件、PCR扩增反应体系略
⑵  PCR扩增产物的纯化与回收
采用小量胶回收试剂盒
⑶  探针标记（随机引物法）
1.  取回收纯化的目的基因扩增产物（待标探针）1μg加无菌蒸馏水定容至16ul。
2.  沸水10 min（使DNA变性），快速置碎冰上冷却。
3.  混匀DIG-High Prime（vial1），取4μl到变性的DNA，混匀并稍离心，37℃反应20h。
4.  加2ul0.2mol/lEDTA（pH8.0）终止反应，-20℃保存备用。

2 基因组DNA酶切
基因组DNA酶切，使用NEB内切酶。
按下表（略）配制酶切反应体系，于37℃水浴中酶切。
3 印迹（高盐转移法）
⑴  凝胶处理
电泳、变性、中和。
⑵  印迹
1.  取一方盘，方盘内加入适量的20×SSC溶液。
2.  方盘上架一块玻璃板，玻璃板上铺一张清洁的Whatman 3MM滤纸，滤纸两端浸没在20×SSC溶液中，滤纸与玻璃板之间不得有气泡
3.  取出中和后的凝胶，倒扣（点样孔向下）于Whatman 3MM滤纸上，用玻璃棒滚动去处胶与滤纸之间的气泡。
4.  剪一块与胶大小相同的尼龙膜（带正电荷），放在无菌超蒸水表面，使之自然吸水下沉。
5.  将膜转入20×SSC溶液中浸泡5min。
6.  将湿润的膜准确的盖在凝胶上面，膜与凝胶接触后，不在移动。
7.  将两张与膜大小相同的Whatman 3MM滤纸置2×SSC溶液中湿润，盖在膜上，排除气泡。
8.  滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸（高8～10cm），吸水纸上放一块大小适宜的玻璃板，玻璃板上压0.5～1kg的重物，水平放置，转移18h。
9.  取下吸水纸及滤纸，接去胶。将尼龙膜于6×SSC溶液中浸泡5min，置滤纸上吸干。
10. DNA印迹面向上，将膜置于Ultraviolet Crosslinker 1,500微焦/厘米2 1min。

试剂：
变性液:  1.5mol/lNaCl，0.5mol/lNaOH
中和液:  1mol/lTris•Cl(pH8.0), 1.5mol/lNaCl
20×SSC: 3mol/lNaCl，0.3mol/l柠檬酸钠 (pH7.0)
2×SSC:  0.3mol/lNaCl，0.03mol/l柠檬酸钠 (pH7.0)
4 预杂交与杂交
1.  预热（42℃）一定体积的地高辛预杂交液(DIG Easy Hyb)(10ml/100cm2膜)，加尼龙膜于装有预杂交液的杂交管中，放入杂交炉温度42℃，预杂交2h。
2.  标记DNA探针（25ng/ml DIG Easy Hyb）煮沸5min，立即置于冰上冷却，使其变性。
3．加变性的标记DNA探针于预热地高辛预杂交液中，混合不产生泡沫（防止产生背景）。
4.  将尼龙膜放入含有探针的杂交液中，放入杂交炉，温度42℃，培养过夜（23～24h）。
试剂：
5 洗膜与显影
1.  杂交结束后，取出杂交膜，迅速置含有洗膜液Ⅰ（预热到68℃）的杂交管中，68℃洗膜2次，各15min；再用洗膜液于68℃最大转速洗膜2次，各15min。
2.  将尼龙膜从杂交管中取出，放入平皿中，室温下，在washing buffer中浸泡5min。
3.  将尼龙膜放入含有100ml 新配制的1×Blocking solution的杂交管中浸泡60min，室温下进行。
4.  膜放入含有10mlAntibody solution杂交管中浸泡40min，室温下进行。
5.  用充足的washing buffer杂交管中最大转速室温洗膜2次，各15min。
6.  将膜放入20mlDetection buffer中平衡2～5min。
7.  将膜DNA面朝上放在培养皿上，加1ml底物液（20μl NBT/BCIP加入1ml Detection buffer中/bottle5），避光显色5～1h。
8.  照相。

试剂：
洗膜液Ⅰ：2×SSC，0.1%SDS
洗膜液Ⅱ：0.5×SSC，0.1%SDS
Washing buffer：0.1mol/lMaleic acid，0.15mol/lNaCl；pH7.5；0.3%(v/v)Tween20
Maleic acid buffer：0.1mol/lMaleic acid，0.15mol/lNaCl；用固体NaOH调节pH7.5
Detection buffer：0.1mol/lTris•Cl，0.1mol/lNaCl，pH9.5
1×Blocking solution：10×Blocking solution(vial6)用Maleic acid buffer稀释10倍（现用现配）
Antibody solution：每次用之前，10000 rpm离心Anti-Digoxigenin-AP(vial4) 5min,小心从表面吸取所需剂量，用1×Blocking solution按1:5000(150 mU/ml)稀释Anti-Digoxigenin-AP。2-8℃可稳定保存12h。

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人生有三样东西不可挽回：时间，机遇，还有说出去的话。

1楼 2008-03-19 12:46:52

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挥汗如雨

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不过我发现自己做的Southern杂交和点杂交的结果共同特点就是膜的中间部分背景还算说的过去（很干净），但膜的两端就总是很脏！而且这两端都是在各步放在杂交管中洗膜的同一方向的两端，是不是在杂交管中洗膜不能把膜背面的非特意结合的探针或抗体洗脱掉，结果照成最后将膜静止放入20ml Detection buffer 中平衡2～5min时，这些膜背面的非特意结合的抗体就都聚集在膜正面某个容易聚集的地方，造成最后显色出现这些局部的背景过深那？

想问一下大家成功完成Southern杂交实验时在洗膜各步是如何洗的?是否也是放到杂交管中？还是放到其它容易使膜前后都彻底得到清洗的器皿中进行的那？

[ Last edited by 挥汗如雨 on 2008-3-20 at 09:56 ]