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wang_zhen铜虫 (小有名气)
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工作液配制 1. 40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）； 2. 4X分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)： 18.2 g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 8.8，加水定容到100ml，4℃ 贮存； 3. 4X堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)： 6 g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 6.8，加水定容到100ml，4℃ 贮存；' 4. 10X电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase， 144 g 甘氨酸，加水定容到1L，4℃ 贮存； 5. 2溴酚蓝上样Buf: 1.25 ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，0.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dH2O； -20℃贮存； 6. 10％APS； 7. 0.25％考马斯亮蓝染色液: Coomassie blue R-250 2.5g，甲醇450ml，HAc 100ml, dH2O 450ml； 8. 考马斯亮蓝脱色液: 100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O 或者 50ml乙醇，100冰醋酸，850ml dH2O 电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正） 1. 碱性非变性胶 17%分离胶(10 ml) 4%堆积胶(5 ml) 2. 40%胶贮液(40%T,3.3%C） 4.2ml 0.5ml 3. 4X分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8） 2.5ml 4. 4X堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8) 1.25ml 5. 水 3.2ml 6. 10％APS 100μl 50μl 7. TEMED 10 μl 5μl 8. 10X电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:100ml稀释到1L 电泳条件 : 100V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶；改换160V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约80min。 染色和脱色:取出胶板于0.25％考马斯亮蓝染色液中染色约30min，倾出染色液，加入考马斯亮蓝脱色液，缓慢摇动，注意更换脱色液，直至胶板干净清晰背景。 也可以用银染或者活性染色。 分离碱性蛋白 要用低pH凝胶系统，并使用以下缓冲液体系： 1. 分离胶：0.06M KOH，0.376M Ac，pH4.3（7.7% T，2.67% C）； 2. 堆积胶：0.06M KOH，0.063M Ac，pH6.8（3.125% T，25% C）； ` 3. 电泳缓冲液：0.14M 2-丙氨酸，0.35M Ac，pH4.5 将正负电极倒置，用甲基绿（0.002%）为示踪剂: 实验操作同分离酸性蛋白。 回收 native-PAGE结束以后，采用电泳的方法进行回收，方法如下 电泳结束以后，切取部分染色，然后根据染色结果切取含有蛋白质的胶带装入处理过的透析袋中，加入适量的缓冲液，最后把透析袋放入普通的核酸电泳槽中，并在电泳槽中加入适量的缓冲液（和透析袋中的缓冲液相同），低温电泳2-3小时即可。回收蛋白所用的缓冲液一般和电泳所用的缓冲液相同。 Native-PAGE注意事项 1. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，蛋白质的迁移率不仅和蛋白质的等电点有关，还和蛋白质的分子量以及分子形状有关，其中蛋白质的等电点是最重要的影响因子，要根据蛋白质的等电点来选择对应的电泳缓冲系统 2. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，要注意电压过高引起发热而导致蛋白质变性，所以最好在电泳槽外面放置冰块以降低温度； 3. 蛋白质的分子量较大，则电泳时间可以适当延长，以使目的蛋白质有足够的迁移率和其它的蛋白质分开，反之亦然; 4. 变性样品的离子强度不能太高（I<0.1mM）。调整样品的PH在4.0左右，这对于能否做好非变性样品非常重要。上样BUFFER 中没有SDS之外，加入样品后不能加热。 Native-PAGE和SDS-PAGE的比较 非变性凝胶电泳，也称为天然凝胶电泳，与非变性凝胶电泳最大的区别就在于蛋白在电泳过程中和电泳后都不会变性。最主要的有以下几点：) 1. 凝胶的配置中非变性凝胶不能加入SDS，而变性凝胶的有SDS。. 2. 电泳载样缓冲液中非变性凝胶的不仅没有SDS，也没有巯基乙醇。 3. 在非变性凝胶中蛋白质的分离取决于它所带的电荷以及分子大小，不像SDS-PAGE电泳中蛋白质分离只与其分子量有关。 4. 非变性凝胶电泳中，酸性蛋白和碱性蛋白的分离是完全不同的，不像SDS-PAGE中所有蛋白都朝正极泳动。非变性凝胶电泳中碱性蛋白通常是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。 5. 因为是非变性凝胶电泳，所有的电泳时候电流不能太大，以免电泳时产生的热量太多导致蛋白变性，而且步骤都要在0-4度的条件下进行，这样才可以保持蛋白质的活性，也可以降低蛋白质的水解作用。这点跟变性电泳也不一样。 |
4楼2014-05-27 22:56:23
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-05-27 22:55:45
wang_zhen: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢你的回答 2014-05-28 09:15:15
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方案1， 30%Acr-Bis: 6.6mL 1M Tris,pH8.8: 3.2mL 10%SDS： 0.05mL 10%过硫酸铵：0.05mL TEMED： 0.002mL 方案2，先自行配制1.1875M Tris,pH8.8 30%Acr-Bis: 6.6mL 1.1875M Tris,pH8.8: 3.2mL 10%SDS： 0.05mL 10%过硫酸铵：0.05mL TEMED： 0.002mL 如果不凝，则10%APS用0.1mL,TEMED用0.01mL. |
2楼2014-05-27 22:30:26
wang_zhen
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