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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 重金求助啊！谁能给俺设计几个引物，并预测一下反应条件？
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小love肖

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by dswjhs at 2014-05-21 09:21:05
1222-2676
多谢恩人搭救！...

你是想用AgeI/EcoRI 双酶切扩增出来的1222-2676段基因吗？这段序列中有2个AgeI位点
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11楼2014-05-21 09:49:34
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dswjhs

禁虫 (职业作家)
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12楼2014-05-21 09:51:51
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小love肖

铜虫 (初入文坛)
1222..2676
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ATGAGTAAAAAAGTATTTTTAAATATTCTAATTTTATTATCTATCTTTCAACTCTCCGCACAAAACGGCAATACTGCGGATCTAAAAGTTCTACTGGACGGTGTGGTCATCATTCGAAGCGATACTTTTTCAGAAAAAGAAGATCAAGATAACTATTCCGAAAAATCAATTTTACGGGACGCTGGTACCGGTATGATCATTTCCGGAAATAGGATTCTTACAAACGCACACGTTGTTTCCAATTCCAGTTATCTCAAAGTAAAACATTTCAATTCTAGTAAATTTTATAAGGCGGAAGTTCAATACCTAGGGTTTGACTGTGATCTTGCAATTCTCAAAGTGGAAGAAGATGAGTTTTTTAGCGGTGTAGAACCTCTGGAAATTTCGGAAGTTTCCCCCGCCCTTGGAAGTAATCTTTTGATTTTAGGTTATCCCGGAGGAGACGAGAACATTACATTAGAAAATGGGAATGTTTCTAGAGTGGAAAGAGTTCGTTATTCCTTTAGCGGTTTAGATTATAGAAAAGCGATCCGTGTCAATGCAAACATCATTCCGGGTTATTCCGGCGGACCGGCCATTCAAAACGGTAGAGTGGTGGGAATTACATTTCAAGTCAGTCAGTCTCAAGGAAACGTAGCCTACTTGATTCCTCCAGAAATTATCAATCACTTCTTAAAAGATGTTGAAGACGGAACCTATCACGGTTTTCCGTTTCCCGGTTTTAGTTTTCAAAACGGTCATTCTTCTTCTTTAAAATCCTATCTTAAAATTCCAGAAGGTCTAAACGGTATTTTGATCAATACGATCTATCCTGATTCTTCTTTTTCAGATCTTTTACAACCGGAAGATTTCGTTTATAAAATTGATAATTCTTATTTAGACGGAGACGGCGGAATTATGGATGAAATAGGAGGTTTTATAGGAGATCTGATCGAAGAAAAATTTATCGGTGACCATATTAAACTTTTCTTTTATAGAAATGGAAAAAACTACAAAGTAGAAGGAACTCTCAAACGCGTTCCTACGTTGGATATTTATAGACAACAAAATAAAAGTTCCAGTTTTTTATCGGGTGGTTTTTTGTTTCAGCCGGTCAATCGAGCACTCGCTGGAGGAGATTCTAAACGTTTGGAAAGTTCTCTTAGATATCATTACAGTTATTATATTCAAGATGAGTTATATCGTTTTACGGACAGAGACATTTTACTTTCGGGTATTTATCCAGATCCGCTTAACTCTAAATATGCGAGTTATCGTTATAAAATTTTAGAATCTATCAACGATCGTACTCCTTCTGATTTGGAAGATTTTAAATCCTTATGGAAAAAATTTTACGGCGGTACGATCAGTTTAAAATTCAGAGGTGTAAACCTTCCTATTATTTTAGATCAAGATACGATCGATAAAATCAATATTCGTATTAAAAAACGCTTCGACGTGGAGGCGGACGAATGA

AgeI/EcoRI 双酶切
引物：
F1   5‘-3’ ATGAGTAAAAAAGTATTTTTAAATATTC      Tm=46.5
R    5‘-3’ GCGAATTCATTCGTCCGCCTCCACGTCGAAG  Tm=75.1
F2   5‘-3’ CGCACCGGTGCCGCCACCATGAGTAAAAAAG  Tm=75.2
先用F1与R从cDNA中扩增，可以55°试试，33个循环，扩不出来可以再降低点温度试试，如果能扩出来，就再用F2与R再扩一次，目的是添加前面的酶切位点，你可以换成别的酶切位点，序列中有一个AgeI位点，55° 25个循环就行，你先试试吧，没办法F1引物的GC含量太低了
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13楼2014-05-21 10:15:47
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dswjhs

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14楼2014-05-21 10:19:52
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dswjhs

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15楼2014-05-21 10:20:34
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小love肖

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
15楼: Originally posted by dswjhs at 2014-05-21 10:20:34
这样的话就没办法用这个AgeI酶了吗？...

不能，那样酶切的话原始序列就不完整了，而且这个酶应该很贵，你可以换别的酶啊，一般载体都有的，HindIII就挺好，我经常用。
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16楼2014-05-21 15:34:52
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dswjhs

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17楼2014-05-21 16:55:18
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dswjhs

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18楼2014-05-21 16:56:42
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kernim

金虫 (正式写手)
引物设计也是我最头痛的事！不过还是要自己学会啊~
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19楼2014-05-22 20:48:36
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dswjhs

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20楼2014-05-22 23:52:48
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