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sunnybomb

金虫 (小有名气)

[交流] 请教重组蛋白纯化问题

His-tag 重组蛋白 用Ni-His层析柱纯化不了，Elute缓冲液中目的条带不明显，且有杂条带。谢谢！本人是这方面的菜鸟，请指教

[ Last edited by sunnybomb on 2008-3-15 at 15:24 ]
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1楼 2008-03-15 11:22:02
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biocore

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 关注,.
可以从以下几步分析原因。
1.含his-tag的重组蛋白，挂住后，流出的液体，去跑个带，如果有很强的目的条带，说明，树脂不行了，没有挂住。更换新的树脂。
2.elute条带不明显，那么加大咪唑的浓度。再看看。
3.有杂带，很有可能，树脂已经失活，有非特异性吸附。

建议更换，树脂。
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2楼2008-03-15 13:45:43
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sunnybomb

金虫 (小有名气)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.. 新虫鼓励奖2个, 让你更开心
我的层析柱是新的，刚用了两次，第一次和第二次出现情况一样。挂住后流出的液体有明显的目的条带，但用Elute洗脱后的溶液有其它小条带，都比目的蛋白分子量要小，会不会是在elute中蛋白不稳定水解掉了。谢谢！
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3楼2008-03-15 15:22:33
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biocore

★
reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.
引用回帖:
Originally posted by sunnybomb at 2008-3-15 15:22:
我的层析柱是新的，刚用了两次，第一次和第二次出现情况一样。挂住后流出的液体有明显的目的条带，但用Elute洗脱后的溶液有其它小条带，都比目的蛋白分子量要小，会不会是在elute中蛋白不稳定水解掉了。谢谢！

从你挂柱后流出的液体有明显的目的条带看，就是his没有挂上去。
买硫酸Ni，来重新装配一下柱子。Ni流式了。所以挂不住蛋白。
加以买原装的。嘿嘿
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4楼2008-03-15 20:50:36
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sunnybomb

金虫 (小有名气)
谢谢指教！我重新试一下
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5楼2008-03-16 20:37:07
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biocore

引用回帖:
Originally posted by sunnybomb at 2008-3-16 20:37:
谢谢指教！我重新试一下

,当然最不幸的情况，就是你的蛋白空间位阻比较大，his没有和Ni结合上。
这样，就要换纯化方法了
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6楼2008-03-16 23:17:35
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