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huaer730

银虫 (正式写手)

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专业: 色谱分析

[求助] 有没高手做过PAR-CLIP？或者了解的？

最近在看文献里涉及的PAR-CLIP 实验，有些地方看不明白
既然在步骤首先用 flag抗体标记的磁珠将细胞蛋白裂解液里的含有flag标签的蛋白沉淀下来了，
那为何还要用γ-32P-ATP标记沉淀蛋白中结合的RNA分子，并且还要SDS-PAGE分离
为什么不能直接测序呢？

顺便问PAR-CLIP和 cross-linked RIP有啥区别？

步骤

1.细胞培养和体外交联 1.在培养皿中培养增殖细胞（15cm 培养板），培养至饱和度为80%。
2.直接加入4-硫尿核苷至终浓度100μM至细胞培养液中。
3.在交联后14小时，每块板中用10ml预冷的1×PBS洗一次细胞，然后完全移除PBS。
4.将培养板放在有冰的托盘上，并且在0.15 J/cm2、356nm的紫外灯下进行照射。5.在培养板中加1ml1×PBS，然后用橡胶棒将细胞刮下
5.将细胞转移到50ml离心管中，4℃下500g离心5min，去除上清液。

2.RNA酶T1消化 1.在沉淀的细胞中加入3倍体积的1×NP-40裂解缓冲液，并且在冰上静置10min。
2.将细胞裂解液在13,000g、4℃下离心15min，弃沉淀。
3.用0.2um膜注射器式滤器进一步清洗细胞裂解液。
4.加RNA酶T1\至终浓度1U/μl并且在22℃水浴锅中孵15min。然后在冰上使其反应5min。

3.预备磁珠 1.每毫升细胞裂解液加入10μ蛋白 G 磁珠颗粒到1.5ml小试管中。用1ml柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液清洗珠子两遍。
2.按照原来珠子混悬液的体积再用两次同体积的柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液重悬。
3.每毫升悬液加0.25 μg特异性抗体，然后在室温进行40min旋转孵育。
4.用1ml柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液洗珠子两次。

4.免疫共沉淀 1.加入20μl新配置的抗体-磁珠处理细胞裂解液(用RNA酶T1处理)，然后在4°C下15ml离心管中旋转混匀1h。
2.用磁力分选器收集磁珠，并转入到1.5ml小离心管中。
3.用IP缓冲液清洗珠子3次

5.第二次RNA酶T1消化以及去磷酸化 1.加入RNA酶T1至终浓度100 U/μl，然后在22°C水浴锅中孵育珠子混悬液15min，接着在冰上静置5min。
2.用高盐缓冲溶液洗珠子三次。
3.用等体积的去磷酸缓冲液重悬珠子。
4.加入小牛小肠碱性磷酸酯酶至终浓度0.5 U/μl，然后在37°C下静置混悬液10min。
5.用1ml磷酸盐缓冲液洗珠子两次
6.在不含有DTT的多核苷酸激酶中洗珠子两次。
7.用原来体积的珠子PNK缓冲液重悬珠子。

6.放射性标记RNA片段并交联免疫共沉淀蛋白 1.加γ-32P-ATP至终浓度0.5 μCi/μl和T4多核苷酸激酶至终浓度1 U/μl到上面的珠子混悬液。37°C下静置混悬液30min。
2.加入无放射性标记的ATP到终浓度100μM，然后再在37°C下静置混悬液5min。
3.用700μl不含有DTT的多核苷酸激酶的缓冲液洗珠子5次。
4.在60μl十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）加样缓冲液中重悬珠子。

7.SDS-PAGE凝胶电泳并洗脱RNA-蛋白复合物和蛋白酶K消化 1.将放射线标记的混悬液在95℃加热器上加热5min（使其变性并释放同交联的RNA的免疫共沉淀的RBP），然后涡旋。
2.在磁力分选器上将磁珠移除，并将上清液转移到新的1.5ml的小试管中。
3.每个孔道中加40μl Novex Bis-Tris 4-12%预处理过的上清液，然后跑聚丙烯酰胺凝胶（200V、55min）。
4.将胶从胶槽中拿出，将胶放在一个平板上。为了使胶上的片段在磷光指示带上被标出，我们植入三个小的放射性的胶段到胶三个角中。放射性胶段能从胶中收集，被最先用来纯化放射性标记的合成寡聚核苷酸。
5.将胶包起来放置在空白的磷光板上扫描1h使其完全显现。
6.将胶摆在磷光板上面，使用植入的胶段来用作定位。将预计的RBP大小片段的胶带切下，然后转移到透析柱中，加入800μl 1×SDS电泳缓冲液。
7.在1×SDS电泳缓冲液中、100V下电洗脱交联的RNA-RBP混合物2h使其从胶中分离出来，切断胶条然后在D型管中电洗脱。
8.加等体积的2×的蛋白酶K缓冲液到电洗脱物中，然后在加蛋白酶K至终浓度1.2mg/ml。55℃静置30min。
9.用酸性的苯酚/氯仿/碘乙酰胺（25:24:1，pH=4.0）来还原RNA，紧接着用氯仿萃取。加1μl糖原（10mg/ml）和3倍体积的乙醇来沉淀RNA。用10.5μl水来溶解沉淀。

8.cDNA库和深入测序（Deep-sequencing和生物信息学分析通过标准制备cDNA库的说明书来处理之前收集到的RNA，并且使用Solexa测序技术。一次的Solexa测序通常能承载6-10百万个片段同时进行，足够覆盖整个转录范围的RNA结合蛋白的结合位点。
为了获得有用的RNA-RBP结合位点的信息，好的生物信息学分析是很需要的。将序列与基因组和EST数据库进行比对。通常，比对的序列不能超过一个碱基的错配，插入、切除直到序列簇的建立为以后的分析都是很有帮助的。

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