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swimmingcrab

铜虫 (小有名气)

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[求助] 原位杂交已有1人参与

各位虫友：
我最近想做石蜡组织切片原位杂交，到网上查了好多资料，但有几个问题还是没有查到，希望各位能帮忙解答下，不胜感激！问题有点乱，还请大家见谅。

1. 4%多聚甲醛需要现配现用么？该如何保存？我看到
2.固定好的组织是否可以经处理包埋后待用？还是每次实验都要取固定的组织进行脱水，透明，浸蜡和包埋？
3.50%的去离子甲酰胺该如何配制和保存？
4. 50%去离子甲酰胺/1×SSC是代表二者体积比1:1的混合溶液么？是要现配现用还是可以保存待用的？如果是，该如何保存呢？
5.整个实验过程中多个步骤用到湿盒，比如杂交，蛋白酶K消化，加抗体等，每次湿盒里的液体都是一样的么？网上查到的实验步骤都没有提到湿盒里的液体是什么。
6. 探针使用前是不是需要用预杂液稀释后变性？具体如何变性？比如温度，时间？另外是先变性好滴加到组织上还是先滴加后一起变性？
7. 杂交温度该如何选择？

之前没有做过这方面的实验，有些问题可能比较外行，还请大家见谅，谢谢大家！

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1楼 2014-05-09 15:18:34

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Duke_Godman

铁虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

1. 4%多聚甲醛需要现配现用么？该如何保存？
提前一天配，60度溶解。另外最好用你的缓冲液配，如PBST等。保存于4度冰箱。建议瓶中少留空气，也就是提前算好体积，液体装满瓶子，拧紧瓶盖。10天的我用过，结果可以保证，再长就不知道了。

2.固定好的组织是否可以经处理包埋后待用？还是每次实验都要取固定的组织进行脱水，透明，浸蜡和包埋？
不知道，没做过石蜡切片的原位。

3.50%的去离子甲酰胺该如何配制和保存？
买的是100%的液体，买后4度保存很久。50%是配好试剂的终体积分数。试剂4度保存，最好现用现配。

4. 50%去离子甲酰胺/1×SSC是代表二者体积比1:1的混合溶液么？是要现配现用还是可以保存待用的？如果是，该如何保存呢？
这一个比例没见过。一般不都是SSC终浓度5或6×么，因为钠离子浓度会影响探针结合效率，最好查明白protocal。SSC母液和稀释液我是4度保存的，无沉淀和晶体，使用效果还不错。

5.整个实验过程中多个步骤用到湿盒，比如杂交，蛋白酶K消化，加抗体等，每次湿盒里的液体都是一样的么？网上查到的实验步骤都没有提到湿盒里的液体是什么。
湿盒液体与玻片滴加的试剂的溶剂相同。比如缓冲液等。

6. 探针使用前是不是需要用预杂液稀释后变性？具体如何变性？比如温度，时间？另外是先变性好滴加到组织上还是先滴加后一起变性？
DNA探针一定要变性。RNA的经过比较实验，变性不变性没啥差别，建议不要变性。条件：80度10分钟。分别变性，降温后再杂交。

7. 杂交温度该如何选择？
我用的65度，效果还行。温度还是要根据具体使用的材料来定。

推荐个帖子给你，我认为你可能会需要。http://www.ebiotrade.com/newsf/2014-5/20145694818349_2.htm

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