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HPLC重点汇总
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HPLC重点汇总 1.除了流速外，还有哪些因素能引起压力改变？ 改变流动相组成和温度； 改变柱长、柱内径和填料粒度； 柱突然阻塞压力升高（正常情况下其它条件不变柱压都是逐渐升高的）。 2.什么是强溶剂、弱溶剂？ 改变流动相的组成或溶剂溶剂强度就可以改变峰容量因子和保留时间。在一定条件下，减少保留时间或缩短分析时间的溶剂为强溶剂，增加保留时间或延长分析时间的溶剂为弱溶剂。 3.怎样才会使峰位发生重排？ 在分析多组分样品时，仅改变流动相的强度（组成百分比）而不改变其组成，一般仅仅改变所有组分的保留时间，不会发生峰位的重排。下列条件改变可能发生峰位重排： 流动相中换了强溶剂； PH值的改变； 柱填料的改变； 柱温的改变； 流动相的组成改变（如加入离子对试剂三乙基胺等）。 4.系统会对峰宽产生哪些影响？ 过样体积、连接管路、各个接头和检测器体积。 5.如何建立一个成功的色谱方法？ 选择合适的液相色谱方法； 选择合适的色谱柱； 选择合适的峰容量因子值的条件； 选择良好的峰位； 选择良好的色谱柱条件； 用实测样品解决出现的特殊问题； 证实方法的正确性。 6.常用的实验室脱气方式有哪些？ 氦脱气，此方法脱气效果最佳，能除去百分之九十以上的空气，但氦气价格太贵，所以用的不多； 真空脱气，效果仅次于氦脱气，但脱气过程中容易造成样品溶液挥发损失； 超声脱气，只能脱去约百分之三十的空气，但在实验室中最常用； 加热脱气。 7.如何评价一个色谱柱的优劣？ 评介一根色谱柱的主要指标是：塔板数、峰不对称因子、柱压降和键合相浓度。 8.什么是时间常数？ 时间常数实际上是响应时间的设定，起着过滤噪音的作用。时间常数太小（太快）可能增加短噪音，时间常数太大（太慢）可能出宽峰、拖尾峰和矮峰。 9.怎么样在实验过程中用改良剂？ 在流动相中加醋酸盐，酸性组分的峰形得到改善，而碱性组分可同时加碱性和酸性改良剂，如1%醋酸盐和10M三乙胺。 10.为什么在实验过程中有时会出现倒峰？ 所用的流动相在检测波长下有吸收，而进在此波长下没有吸收的溶剂，在流动相中会出现洞穴，通过柱后出现倒峰。 11.为何会出现“胖”峰和平头峰？怎样避免？ 用比流动相强度大的大体积样品进样，通常会损害色谱图的质量。应遵循下列规则选用溶剂溶解样品：A最好用流动相溶解样品进样10-15。B用大体积弱溶剂溶解样品，如反相色谱中用水溶解样品进样100-500。主要缺点是每次进样后在色谱图的开头出现大的负峰，有时还波及到样品峰。C需要时用10-25强溶剂溶解进样。 12.什么是次级保留效应？ 在良好的色谱分离中，样品分子是以单一的保留过程被保留。如在反相色谱中，溶质与柱填料的非极性烷基链发生疏水性相互作用。但在以硅胶为基质的填料中，有些样品组分能与硅醇基团相互作用。这是次保留过程，使峰严重拖尾。有限的强基质被消耗掉，柱对有些组分过载，这些过载组分继续与次级基质发生相互作用，发生作用后，脱附的过程很慢，引起了峰拖尾。对付次保留效应最有效的方法就是加入一些流动相改良剂。 13.前延峰的发生及处理？ 因柱温问题很易引起前延峰，有些样品在常温下分离可见前延峰，升高温度后前延峰的现象消失。在离子对色谱中，前延峰的另一个原出是用非流动相作样品溶剂。因此在离子对色谱中要求仅用流动相溶解样品，而且进样量不要大于25-50，否则会导致前延峰或其它问题。造成前延峰的第三个原因是流动相分离阴离子样品很快从填料的孔隙中被排斥出来。使用高浓度缓冲液，即增加流动相的离子强度，可以克服前延峰的效应。 14.峰变宽的原因？ A在使用过程中柱本身退化，逐渐降低柱效。B柱外峰宽效应。一根专用柱用于另一液相色谱系统可能引起塔板数降低，说明新系统有很大的柱外峰宽效应。C化学效应。色谱因素和化学因素同时影响塔板数。色谱因素前已述及，化学因素多数是流动相和固定相相互作用所致。改变流动相可使宽峰有所改善。 15.柱平衡慢的常见原因有哪些？ 柱平衡慢的常见原因是，组分在旧的或新的流动相中对柱吸附强，或者在新的流动相中浓度小甚至为零。 A流动相含有胺改良剂；B流动相含有离子对试剂；硅胶柱；流动相中有四氢呋喃。 可考虑采用专用柱用于特殊的方法（上面提到的四种情况的一种），不用时将柱折下来，注满适当的溶剂或流动相，密封保管，不再作其它的分析。 16.用内标法实验时对内标物的要求有哪些？ A内标物的结构或理化性质应与被分析组 分相似或相近；B内标物的保留值应稍大于或小于被分析物的保留，不能相差过大；C内标物的峰要与所有被分析物的峰有良好的分离度（R大于1.5），不能让内标物成了干扰物；D无结构相似的内标物，可用保留相近的内标物。 17.梯度洗脱的问题？ 正常的梯度洗脱用于分离极性范围广的组分，最后一个峰的等度保留必须大于第一个峰。在等度分离中，第一个峰与最后一个峰的K'比应大于30，这样用梯度才有好的结果。在等度洗脱中前面峰的K'值很小，后面峰的很大，而梯度洗脱使流动相强度不断变化改变了K'值。在梯度洗脱中，弱保留组分在弱流动相中首先离开柱，而强保留组分在强流动相中最后离开柱。可心粗略地估计一下，梯度洗脱中所有的峰有相同的K'值和相同的峰宽。 18.什么是柱温箱失控？如何引起的？ 在打开柱室加热电源之后，如果柱室实际温度一直上升而不受柱室温度设定值的控制，则为柱室温度失控故障。柱室温度失控故障的原因有：A可控硅击穿B加热丝与机壳相碰C铂电阻线路短路D温度敏感桥路给定电阻一路开路E柱室温度控制板有故障。 19.管子切割的注意事项？ A管子的断面必须垂直，否则，将会产生死体积而引起色谱峰峰形扩展。B确保管子内表面不被损伤，如果损伤，可能会发生管路堵塞。C将不锈钢的螺帽和刃环安装在SUS管上，树脂的螺帽和刃环安装在树脂管上。如果树脂螺帽安装在SUS管上，可能会导致螺帽损坏及液体泄漏。D将管子完全插入开口端，直至其与开口端的末端相碰为止。否则，将会产生死体积而引起色谱峰峰形扩展。E不要过分拧紧螺帽，以防损坏螺纹。 20.液相色谱和气相色谱常用检测器各有哪些？ A液相色谱选择型检测器：UVD-紫外吸收检测器（ultraviolet absorption detector)高效液相色谱仪中使用最广泛的一种检测器，它分为固定 波长，可变波长，可变波长和二极管阵列检测器三种类型；PDAD-二极管阵列检测器（photo-diode-array)是20世纪80年代发展起来的一种新型紫外吸收检测器，它与普通紫外吸收检测器的区别在于进入流通池的不再是单色光，获得的检测信号不是在单一波长上的，而是在全部紫外光波长上的色谱信号。因此它不仅可进行定量检测，还可提供组分的光谱定性的信息；FD-荧光检测器(fluorescence detector)是利用某些溶质在受紫外光激发后，能发射可见光（荧光）的性质来进行检测的；ECD-电化学检测器，通用型检测器：ELSD-蒸发光散射检测器(evaporative light scattering detector)它能对各种物质均有响应，且响应因子基本一致，它的检测不依赖于样品分子中的官能团，且可用于梯度洗脱，样品组分从色谱柱后流出，进入检测器后，经历了雾化、流动相蒸发和激光束检测三个步骤；RID-折光指数检测器（refractive index detector)以又称示差折光检测器，它是通过连续监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测定试样浓度的检测器。由于每种物质都具有与其他物质不相同的折射率，因此RID是一种通用型检测器，此类检测器般不能用于梯度洗脱，因为它对流动相组成的任何变化都有明显的响应，会干扰被测样品的监测。按工作原理又分为反射式、偏转式和干涉式三种。 B气相色谱选择型检测器：ECD-电导检测器（electrical condactivity detector)是一种选择性检测器，用于检测阳离子和阴离子，其在离子色谱中获得广泛应用。由于电导率随温度变化，因此测量时要保持恒温，它不适用于梯度洗脱；FPD-火焰光度检测器；NPD-氮磷检测器，通用型检测器：TCD-热导池检测器；FID（有机物)-氢火焰离子化检测器。 21.高效液相色谱法的分类？ 按溶质在两相分离过程的物理化学原理分类： A吸附色谱：用固体吸附剂作固定相，以不同极性溶剂作流动相，依据样品中各组分在吸附剂上吸附性能的差别来实现分离；B分配色谱：用载带在固相基体上的固定液作固定相，以不同极性溶剂作流动相，依据样品中各组分在固定液上分配性能的差别来实现分离，根据固定相和液体流动相相对极性的差别，又可分为正相分配色谱和反相分配色谱。当固定相的极性大于流动相的极性时，可称为正相分配色谱或简称正相色谱，若因定相的极性小于流动相的极性时，可称为反相分配色谱或简称反相色谱；C离子色谱：用高效微粒离子交换剂作固定相，以具有一定PH值的缓冲溶液作流动相，依据离子型化合物中各离子组分与离子交换剂上表面带电荷基团进行可逆性离子交换能力的差别而实现分离；D体积排阻色谱：用化学惰性的多孔性凝胶作固定相，按固定相对样品中各组分分子体积阻滞作用的差别来实现分离。以水溶液作流动相的体积排阻色谱法，称为凝胶过滤色谱，以有机溶剂作流动相的体积排阻色谱法，称为凝胶渗透色谱法；E亲和色谱：以在不同基体上，键合多种不同特性的配位体作固定相，用具有不同PH值的缓冲溶液作流动相，依据生物分子（氨基酸、肽、蛋白质、核碱、核苷、核苷酸、核酸、酶等）与基体上健联的配位体之间存在的特异性亲和作用能力的差别，而实现对具有生物活性的生物分子的分离。 按溶质在色谱柱洗脱的动力学过程分类： A洗脱法又称淋洗法：如将三组分的样品注入色谱柱，流动相连续流过色谱柱，并携带样品组分在柱内向前移动，经色谱分离后，样品中不同组分依据与固定相和流动相相互作用的差别，而须序流出色谱柱。此法在液相色谱分析中获得最广泛的应用；B前沿法又称迎头法：如将含三个等量组分的样品溶于流动相，组成混合物溶液，并连续注入色谱柱，由于溶质的不同组分与固定相的作用力不同，则与固定相作用最弱的第一个组分首先流出，其次是第二个组分和第一个组分混合一起流出。此法仅第一个组分的纯度较高，其它流出物皆为混合物，不能实现各个组分的完全分离，现已较少使用；置换法又称顶替法：当含三种组分的混合物样品注入色谱柱后，各组分皆与固定相有强作用力，若使用一般流动相无法将它们洗脱下来，为此可使用一种比样品组分与固定相间作用力更强的置换剂（或称顶替剂）作流动相，当它注入色谱后，可迫使滞留在柱上的各个组分，依其与固定相作用力的差别而依次洗脱下来，且各谱带皆为各个组分的纯品，置换法现已在大规模制备色谱中获广泛应用，在生物大分子纯品制备中取得良好的效果。 22. 什么是HPLC的“无限直径效应”？ 在HPLC分析中由于使用了高效微粒固定相及高压流动相，样品以柱塞式注入色谱柱后，因柱的阻力大，样品分子在柱中的分子扩散很小，直至它从色谱柱流出也未与色谱柱内壁接触，因而引起的色谱峰形扩展很小，能保持高柱效。 23.如何评价一台检测器？ A噪声：通常噪声是指由仪器的电气元件、温度波动、电压的线性脉冲以及其他非溶质作用产生的高频噪声和基线的无规则波动；B基线飘移：漂移是基线的一种向上或向下的缓慢移动，可在较长时间（0.5~1h）内观察到。它可掩蔽噪声和小峰。漂移与整个液相色谱系统有关，而不仅是由检测器引起的；C灵敏度（最小检出浓度或最小检出量）：在一个特定分离工作中， 检测器是否有足够的灵敏度是十分重要的。当比较检测器时，常 使用敏感度这一性能指标。敏感度既指信号与噪声的比值（信噪比）等于2时，在单位时间内进入检测器的溶质的浓度或质量；D线性范围：在进行定量分析时，希望检测器有宽的线性范围，以便在一次分析中可同时对主要组分和痕量组分同时进行检测；E检测器的池体积：它应小于最早流出的死时间色谱峰的洗脱体积的1/10，否则会产生严重的柱外谱带扩展。 [ Last edited by 佳怡 on 2009-4-28 at 21:28 ] |
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