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[转贴]HPLC液相操作经验集锦
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本帖是转自仪器信息网论坛中的精华帖，希望能够为大家提供一个比较好的参考…… 【原创】色谱经验集锦 cbjcn1985 一.做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在?如何解决? 原因可能有： 二.请问HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法" 1. 样品量不足：解决办法为增加样品量； 三.液相色谱仪色谱柱使用及维护
四.用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在?如何解决? 关于漂移问题： 五. C18柱出什么问题了?买了一根 Kromasil 100－5C18柱，刚开始用时效果较好，条件为30mM KH 2 PO 4 ，pH=2.00，柱温30度。连续使用大约两天后，各标准品峰明显前移。有些原来能分开的峰，现在用同样的条件已经分不开了。最近我继续使用该柱，不同的是每天连续使用时间不超过12小时。使用后先用5%甲醇/水冲洗，再用100%甲醇冲洗。这样使用了三天，峰的保留时间不再前移。 因此，我有二个问题： A 峰的前移是由于C18被水解的缘故吗？如不是，又是什么原因呢？ B 对于使用低pH纯水系缓冲盐的C18柱，每天使用12小时，用5%甲醇/水洗净缓冲盐，再用甲醇冲洗，能延长C18柱的使用寿命吗？ 使用Kromasil 100－5C18出现这种情况是不了解这种柱子的特性。关于上面的二个问题，作如下分析： 六.走空白梯度，在 11-13min出现未知的异常峰，并且峰值还挺大，有机相从0%-100%，这是为什么？ 一般走空白梯度是不进样的，大多数情况这些异常峰是流动相本身造成的。在等度洗脱的情况下，流动相的少量杂质一般不会影响基线和噪音，这些杂质要么不出来，要么不间断出来，不会产生异常峰（鬼峰）。对于梯度洗脱，水相或有机相中的强保留杂质在开始洗脱时，由于有机相的比例低，在柱子上保留而不洗脱，但当流动相中有机相比例不断加大，在色谱柱中吸附浓缩的杂质开始被洗脱，从而在某些位置出现异常峰（鬼峰）。还有，如果梯度设置不当，流动相比例变化太快，紫外波长较低时也容易出现异常峰。另外需要注意的是，如果梯度泵的比例阀有问题或流动相混合器效果不好或有少量的气泡存在，也会出现这种现象。因此，对于梯度洗脱，大多数原因在流动相，所以流动相的纯度非常关键，尤其是水的纯度以及添加的流动相改性剂的纯度。 七.我最近更换了另一种牌号的ODS柱，虽然分离情况仍可以，但保留时间不能重现，为什么? 这是因为被分析物可能具有形成氢健的能力。尽管过去几年来，填料的制造技术有了极大的提高，但不同的厂商的ODS填料表面硅醇基的浓度不同。正是这些硅醇基可能与样品发生相互作用。因此，同一被分析物中的各组分在不同牌号的ODS柱上的相对保留时间就可能不同。在流动相中加入少量竞争物，如三乙基胺 (TEA)，将会使硅醇基的成键能力饱和，从而保证不同牌号柱子上的相对保留时间具有较好的重现性。 链接来自： 仪器信息网论坛液相色谱版(http://www.instrument.com.cn/bbs/shtml/20080117/1139278/)
[ Last edited by 佳怡 on 2009-4-28 at 20:52 ] |
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