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蓝默儿

金虫 (小有名气)

[求助] 腹水,辛酸-硫酸铵纯化 已有2人参与

腹水亚型是IgG1,纯化之前测其浓度为20毫克/毫升,纯化测其浓度为800微克/毫升,重复做了两次

具体步骤为:
1、 离心。12000rpm,5min,取上清于小烧杯中。
2、上清用0.45nm滤膜过滤。
3、加4倍体积PH4.5的醋酸缓冲液,边加边搅拌。
4、混合后,按每毫升稀释腹水加33ul的正辛酸,边加边搅拌。
5、室温搅拌30min,,取出12000rpm,离心30分钟,弃沉淀。
6、上清用0.45nm滤膜过滤,滤液调PH=7.4.
7、加入饱和硫酸铵至45%饱和度,搅拌30分,4°过夜或5小时以上。
8、4° ,12000rpm,离心30分钟弃上清保留沉淀,
9、10mMTris (PH=9.0)重悬沉淀,用透析卡进行透析过夜4°,
10、4°,12000rpm,5min取上清,定容,测下浓度。

别的实验室按次方法做没问题,就是第6步,我用滤膜过滤,他用滤纸过滤。不知为什么我的浓度好低,求高手指点
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微笑,自信,加油
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幸运星图

新虫 (初入文坛)

您好,您这边先用正辛酸然后用饱和硫酸铵,我的方法与之一致,只是方法步骤相反,先用饱和硫酸铵后用正辛酸,透析前后检测两者浓度相差10倍,检测基本上上没有蛋白含量,用两步法进行纯化蛋白有双重除杂功能,蛋白含量会明显降低,故而自身纯化是自身的蛋白含量必须高才可行,但是在透析前检测了蛋白含量子在1mg/ml左右,透析后检测蛋白浓度只有0.1mg/ml,透析液为PBS,重复两次依然是此现象。
14楼2017-05-09 11:14:37
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蓝默儿

金虫 (小有名气)

我觉得第6步的滤纸或滤膜过滤都是没问题的,只是为了除杂,只觉得滤膜过滤效果更好了。
微笑,自信,加油
2楼2014-04-14 10:12:52
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wys476488620

金虫 (正式写手)

用滤纸的是不是你做的 ?   其它步骤 你确定 他和你的做法一样 你亲眼看了没
踏踏实实的就行了
3楼2014-04-14 12:37:56
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蓝默儿

金虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by wys476488620 at 2014-04-14 12:37:56
用滤纸的是不是你做的 ?   其它步骤 你确定 他和你的做法一样 你亲眼看了没

他用的滤膜,我用的滤纸,基本细节都告诉了,我自己也上网查找,才做的实验。你觉的哪出现问题了,谢谢
微笑,自信,加油
4楼2014-04-14 13:21:58
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