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lindan0107

禁虫 (小有名气)

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annwt

木虫 (正式写手)

★ ★ ★ ★ ★ ★
lindan0107(金币+6,VIP+0):没有说到我想要的!
^_^,大片段连接的确具有挑战性,我的看法是:
1,连接体系中载体与基因的浓度一定低,高了就不好连,作过反向PCR的都知道,
2,连接酶单位太多了应该也不好,Taq里有甘油,连接酶里也应该有,甘油多了反而酶活性低。
3,如果是导入细菌,最关键是感受态,大片段应该用超感,分子克隆上有方法,大片段进入细胞不太容易,操作时应该格外注意,尤其是热激后,可以等的时间长些,
2楼2008-02-26 09:58:27
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lindan0107

禁虫 (小有名气)

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3楼2008-02-26 20:29:36
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annwt

木虫 (正式写手)

我曾经连过2.4kb的,T载体只用0.5微升(说明书要求1微升)到0.3微升,至于反向PCR的问题,我问过成功人士,他们的经验是浓度越低越容易成功,这里可能涉及到化学问题,他也没有解释清楚,不过我的确没有记错。
4楼2008-03-03 13:30:55
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