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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 重组质粒双酶切后没有条带
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by wxl.1989822 at 2014-03-06 22:04:23
构建成了 酶切位点估计没有问题...

你试着切个100ng，然后全部点样检测。我觉额么有可能是量少了。
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11楼2014-03-07 08:58:45
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wxl.1989822

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 西门吹雪170 at 2014-03-06 21:42:46
这也是经常遇到的问题，重组质粒大小正确，进行PCR验证也有出现目的条带，但是就是酶切不出条带，建议你测一下重组质粒的浓度，然后按最终反应体系质粒的浓度约为20ug/uL进行计算所需加样的量，试试看吧，一般这样是 ...

20ug/ul?这么大
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12楼2014-03-07 09:16:39
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)
引用回帖:
12楼: Originally posted by wxl.1989822 at 2014-03-07 09:16:39
20ug/ul?这么大...

这还大啊，我们同学有时用的比这个浓度还大，都切开了
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植根于内心的修养；无需提醒的自觉；以约束为前提的自由；为别人着想的善良
13楼2014-03-07 09:37:30
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
你每次酶切的重组质粒大约有多少ng？
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14楼2014-03-07 10:54:39
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wxl.1989822

金虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-03-07 10:54:39
你每次酶切的重组质粒大约有多少ng？

我测了下浓度大概在60ng/ul,我加的有16 14 12 8 4ul 等，在20ul 的酶切体系中。
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15楼2014-03-07 15:14:50
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wxl.1989822

金虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 西门吹雪170 at 2014-03-07 09:37:30
这还大啊，我们同学有时用的比这个浓度还大，都切开了...

你确定是ug/ul，不是ng/ul?
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16楼2014-03-07 15:17:02
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wxl.1989822

金虫 (小有名气)
我今天又做了单酶切也是一样的效果 弥散，看到其他的帖子说可能是质粒没提好，但是我的空质粒跑的没问题啊
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17楼2014-03-07 15:31:22
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by wxl.1989822 at 2014-03-07 15:14:50
我测了下浓度大概在60ng/ul,我加的有16 14 12 8 4ul 等，在20ul 的酶切体系中。...

试下8ul，切6h。
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18楼2014-03-07 17:06:42
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wxl.1989822

金虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-03-07 17:06:42
试下8ul，切6h。...

切这么久 我觉得应该是我的质粒浓度太低 酶活性过高 切碎了
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19楼2014-03-07 18:28:42
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
19楼: Originally posted by wxl.1989822 at 2014-03-07 18:28:42
切这么久 我觉得应该是我的质粒浓度太低 酶活性过高 切碎了...

切2-3小时也行，0.5ul酶对应500ngDNA
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20楼2014-03-07 18:35:51
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