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核酸抽提常见问题解答
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1.问题解答 A 抽提过程中的现象及可能的原因 I：核酸不溶解或者难溶解 – 蛋白质残留 (虽然目前更多的资料强调的是过分干燥所致。)。75%乙醇洗涤后，如果是空气干燥，几乎不可能过分干燥的，尤其是在南方潮湿的地方。佐证实验：撕取少量 Merck 的丝状CT DNA到一个离心管中，加入无水乙醇；10 分钟后彻底去除乙醇；待乙醇完全挥发后，加入 TE，10 分钟后溶液就非常均匀而粘稠了。 II：使用异丙醇沉淀核酸，沉淀为白色 – 多糖残留。 III：核酸溶解后为乳白色 – 多糖残留。 IV：75% 乙醇洗涤异丙醇沉淀的核酸时，沉淀变大了 – 见 10-III。 B 紫外检测 I：A260/A280 比值低 – 蛋白质残留。但如果操作过程中使用了苯酚，则更可能是苯酚残留。 II：A260 值提示的含量与电泳检测时提示的含量有可见的误差 – 苯酚残留。C 电泳中的现象及可能的原因 I：加样孔有荧光 – 首先一定有 DNA 的滞留；其次多含蛋白质残留；如果是比较特殊的样品，其杂质也可能导致荧光。蛋白质几乎不会被 EB染色，能出现荧光，则一定含有核酸。非常巨大的基因组DNA (>50kb)，如果使用普通的琼脂糖电泳，往往不能电泳出孔，单独就可能滞留在加样孔中产生荧光。更多的时候，是比较大的 DNA与残留的蛋白质结合后，电泳不能出孔而在孔中产生荧光。酶反应产物，如果没有经过纯化去除酶，也非常容易在孔中出现荧光，其原因是酶与核酸几乎都有比较强的结合能力 (基因组 DNA 的PCR产物电泳往往在孔中都有荧光，而且荧光强度与体系的特异性成反比。)。如果是植物样品，还可能由其它杂质残留引起。我的经验是：蛋白残留的荧光有点发闷，其它杂质残留亮得很刺眼，且薄得锐利。 II：总 RNA 非变性电泳显示过多的条带 – 根本就不是问题。 III：总 RNA 非变性电泳显示 28S 不如 18S 亮，但条带清晰无弥散 – 多提示 28S 没有被 EB 饱和。RNA 残留多时，基因组 DNA 的电泳也会有相似现象。简单的补染可以解决此问题。再次电泳时，或者降低上样量，或者增加胶中 EB 的量。 D 降解的现象、原因及对策 降解的现象，如果抛开问题电泳所致，可以简单总结如下：主带不再突出，向小片段方向发生弥散，亮度比较均衡地衰减。如果同时还伴随下列的一个或者多个现象，则需要更进一步的检测：加样孔非常的亮、弥散发生在主条带位置的上下两个方向、从加样孔即开始发生弥散。 以现在的裂解液的裂解能力而言，降解的发生主要是在彻底匀浆之前，只有极少量由不干净的溶解液导致。以总 RNA 抽提为例，本站就有帖总结为：总RNA 的质量由高到低依次为悬浮细胞、贴壁细胞、组织(此处的质量不仅指纯度，也指完整性才对)。彻底裂解悬浮细胞的时间最短，彻底裂解组织的时间最长，这就是降解多发生在彻底匀浆之前的一个佐证。再看一看新鲜样品和冷冻保存样品，非常严格的冷冻保存和匀浆操作的确可以确保冷冻样品的核酸的质量；但是，有许多实验室并不具备严格的保存手段，实验人员的操作也并非完美，其结果就是核酸的降解。RNA 抽提受的影响因素太多，就以基因组 DNA 的抽提为例看一看吧。假定消化使用的是含蛋白酶 K的溶液，无论你使用的是新鲜样品还是冷冻保存样品，如果混匀彻底，可以预期的降解为：细胞 – 不应该降解，碾碎的组织 – 不应该降解，大块组织(包括鼠尾) –部分降解。如果电泳发现新鲜的细胞和碾碎的新鲜组织发生了降解现象，该现象是假象；如果电泳发现冷冻的细胞和碾碎的冷冻组织发生了降解现象，该现象不是假象，就是样品在保存中已经降解了。说得更极端一点，即使蛋白酶 K 失活了，消化试剂的裂解能力也足以保证细胞的基因组 DNA在抽提过程中间不被降解。 减少或者杜绝核酸降解，一定要将重点放在样品被彻底匀浆之前。样品的保存在前面已经说过了，不重复。其次就是要缩短样品从脱离原来的生存环境或者低温到被彻底匀浆之间的时间。 E 后续酶反应失败 资料书中连篇累牍的原因我就不说了，因为都对。我相信因为大家首先相信的就是它们，所以碰到问题首先一定会从那些方面着手。如果三次实验后，问题还没有解决，那么 90%的可能在于洗涤方式的不严格导致的小分子物的残留。小分子物像刀，可以陆续“杀”死很多酶；大分子物如蛋白质，像绳子，只能“捆住”一个目的核酸或者酶。更严格的洗涤可以解决该问题。 F 蛋白质是如何残留的 PC 纯化：a-取上清时取到中间层及下层；b- PC 用量不足；c-混匀不彻底；d-溶解于上清中的少量 PC 中含有的蛋白质。 高盐沉淀：a-取上清时取到了蛋白沉淀；b-裂解不彻底；c-裂解液用量不足，使裂解体系太粘稠；d-溶解度问题 (可以使用低温沉淀加以改善)。 介质：a-裂解不彻底；b-裂解体系太粘稠。G 小分子物质 (苯酚、盐) 是如何残留的 醇沉淀：洗涤不彻底。其原因与管子、操作手法等有关。 介质：颗粒状介质的原因与醇沉淀相同。柱式的几乎都是柱子设计上的缺陷所致，极少数由操作者未严格按要求操作所致。 2：一些特别的问题 a：EP 管的问题 几乎没有人会认为 EP 管的质量会与核酸抽提的操作有关，与某些现象 (如核酸在 -20C 保存一天后发生了降解) 有关系，但事实是，EP 管的质量的确与核酸抽提的质量以及核酸保存时的稳定性有关。 硅化可以提供最高质量的 EP 管，使某些奇怪的现象消失或者大大减轻。最糟糕的 EP 管对液体有较强的吸附力，在倾倒液体时残留多，核酸在管中保存的过程中会发生变性。这样的管子是很有市场的，因为便宜；而正因为便宜，其材料总是不令人放心的。 我个人认为，只有硅化过的 EP 管，才可能按照标准操作获得满意的结果。否则，某些操作步骤必须调整，才可以获得稳定的质量。 b：核酸抽提中的温度问题 核酸抽提中的温度问题，也是一个值得关注的问题。首先要明确的一点是，任何一个温度条件，对某些方面有利，同时也一定会有不利的一面。如沉淀，低温操作会提高得率，但也会增加杂质的残留。任何一步操作该用什么温度为好，应该是利弊权衡的结果。基本上，除了一些特殊的步骤，如消化等外，用室温是最好的选择。那些认为“低温操作可以防止或者减少降解”之类的理由，并没有多少可操作性的。低温的确可以减低酶的活性，但低温同时也降低了这些酶被裂解液中的试剂灭活或者抑制的速度，此消彼长，没有办法给出结论的。就 RNA 抽提而言，彻底匀浆前在冰上操作可以降低 RNA 被降低的风险，彻底匀浆后的温度对RNA 的完整性影响已经不会大的；如果发现影响很大，说明 RNase没有被裂解液有效抑制，提示裂解液的用量不足。更没有道理的是认为低温沉淀和低温洗涤可以防止降解了。事实上，核酸一旦被沉淀下来，对酶的耐受力是很强的，这就是核酸保存在醇溶液中最稳定的理论基础。如果说沉淀使用低温还可以提高得率，洗涤使用低温又是为什么？彻底的错误而已。 c：如何阅读操作手册 拿到操作手册后，要倒着阅读：先阅读问题解答，再看操作步骤下面的说明，再看操作步骤。问题解答是别人在使用过程中曾经碰到过的问题集锦，操作步骤下面的说明是商家的警告。没有一个商家会将他的操作步骤写得非常复杂，因为这是满足使用人员习惯的结果。一句话，PS 和 By the Way之类的话中含有真正的有用素材。 3：延伸的思考 a：标准化的概念 所谓的标准化，指的是一套程序，确保不同的人能获得质量接近的产物的程序。标准化并不是以获得最高质量为目标，而是以稳定为目标。标准化的核心是质控。 事实上，核酸抽提的每一步操作，都有一个核心；重要的是找到可观察的指标或者现象作为参考，从而确保实验的成功。如悬浮的核心是没有块状物的存在，彻底消化的核心是没有块状物的存在，PC 抽提的核心是混匀-两相成为乳状，取上清的核心是用小一点的移液器移取液体，吸取时 Tip的尖头尽可能接近液面，吸取速度要慢，并且要留下 1mm以上的液体不要再吸。去上清的核心是先倒空，再短暂离心将残留液体离到管低，用移液器彻底移出。洗涤的核心是彻底悬浮沉淀，并且要放置一段时间(时间长短与沉淀大小有关) 使沉淀内部也能被洗涤到。按这样的方法抽提的核酸，其质量是非常稳定的。 柱离心式实际上就是非常标准化的核酸沉淀与洗涤的操作。一般而言，如果严格按照操作步骤去做了，柱式操作出问题，系统性的与试剂盒有关，偶然性的与操作有关。这一点，应该是可以理解的。 一个方法，其标准化程度越高，其稳定性就越好。步骤越少，标准化就越容易。产品的开发也要以高标准化程度为目标。 b：QC 的概念 QC(质控) 概念远没有 QT (质检) 概念深入人心。最高境界的产品追求的是免检，或者是Trouble-free。另外，现在的许多产品也是不允许 QT 的 (因为是一次性的)，因此就只能靠 QC 来保证质量了。QC是将精力集中在过程中：原料、操作等。只要严格按照标准去做，最终的结果就有保证。事实上，很多实验人员是不做检测而直接将抽提好的核酸用于后续实验的；他们之所以可以这么做，是因为他们有意无意之中非常的注意 QC。也有不少人，尤其是新手，Pay no attention toQC，只知道最后的 QT。一旦发现问题，就去逆推原因；但因为过程中所出现的现象根本就没有注意，几乎不可能准确找出真正的原因的。如果 QC做得好，最后的 QT 是否全部做/部分做/完全不做，取决于时间、经验、后续实验的成本等因素。c：其它 核酸抽提的每一步操作，都是利弊权衡的结果。消化要彻底，时间就会长；PC抽提时多取上清，得率会提高，但增加了蛋白质污染的风险；沉淀使用低温且延长时间，得率会提高，但增加了杂质污染的风险总之，核酸抽提是艺术，可以根据自己的样品及当时的情况，对操作步骤进行适当的优化。 d：实验的思维 核酸抽提的成功，就是每一步都没有失败。这不是玩文字游戏，而是告诉你做实验的良好思维。就如同小学基础没有打好，早晚会发现大问题一样，做实验决不要以成功为喜悦，以失败为痛苦。要保证实验成功，绝对不能有“这个操作应该没有问题”，“用这个可能不会有问题”之类的侥幸心理。去掉任何一个可能使实验失败的因素，这才是实验该有的出发点。用这样的出发点，实验几乎没有不成功的，所以说，实验成功没有什么快乐；实验的快乐来自于：发现自认为不会导致失败的某因素实际会导致实验的失败。学到了这样的知识，才有快乐的理由。 e：EB 在 NA 抽提中的运用 EB 在 NA抽提中的应用，用于电泳，人皆尽知；用于 gDNA 抽提时提高蛋白质与 gDNA 的分离效率，却似乎没有人再考虑了，因为大家都怕使用 EB。在NA 抽提中涉及到 EB 的另外一大类，就是胶回收操作了；EB 在胶回收中扮演的角色，就不完全是正面的。 如果 NA 与 EB充分接触，EB 就会以每隔数个碱基的频率均匀地插入 NA 之中。EB的这种插入，无疑更可能破坏核酸双链的稳定性，使核酸由双链变成单链的压力增加。如果核酸比较短，而错配又多(错配的后果之一也是核酸容易由双链变成单链)，EB 的插入将更容易导致变性的出现。这个观点有如下的实验报告佐证：有相当部分的 PCR产物胶回收实验，都报告说回收后的电泳结果是：目的条带变淡或者消失，同时出现了一条小的原来不存在的条带。 坛中曾有文描述他做胶回收的程序：两边加 Marker，中间加产物；电泳过程不含 EB。电泳结束后，纵向割下 Marker 条带用 EB染色后，放回胶原来的位置。开紫外，根据 Marker的位置割下目的条带，再回收。这是个笨办法，但这样使用的人一定是聪明人。如果这个办法仍然不能消除变性，则只能使用高保真的酶了。 f：蛋白质残留的影响问题 (探讨，没有证据) 一直对蛋白质残留不抱好感，却也没有将它看成威力无比。本节考虑的是蛋白质对酶反应的影响问题，为方便表述，我将残留的蛋白质分成同源的 (与核酸或者酶有同一或者相似的来源，如细菌) 和异源的(与核酸或者酶没有同一或者相似的来源) 两种。 先看异源蛋白质的影响：内切酶几乎都在保存液中添加有 500ug/ml 的 BSA，BSA 是改善 PCR 结果的一个选项，BSA是稳定低浓度核酸的一个选项。几乎都是正面的。可以看到，异源蛋白质对酶反应没有抑制作用，甚至还有促进作用 (虽然都是以 BSA 为例)。 再看同源蛋白质的影响：AMBION 公司有一个非常有特点的产品 “Cells-to-cDNA Kit”。细胞裂解后不去除蛋白质就直接用于RT-PCR。该例子应该可以说明，与核酸同源的蛋白质的残留对 RT-PCR不一定有影响。另外一个例子是质粒的酶切。质粒酶切是比较容易出现一些靠 PC 纯化一次就可以解决的问题的；因为 PC纯化基本上就是去除蛋白质，所以可以认为质粒抽提中残留的蛋白质对酶切是有巨大影响的。各位看官是否注意到这两个例子的最大区别在什么地方？区别在于残留的蛋白质究竟是与核酸同源还是与蛋白质同源。事实是，质粒抽提中残留的蛋白质是宿主菌的 (Ecoli或者其它)，与质粒并不同源；而内切酶却是来自于 Ecoli 或者其表弟表妹的，与宿主菌的蛋白质同源性是非常高才对。还有一个现象：EcoR I的 Star Activity 是最明显的，其它来源于 Ecoli 的酶的该活性也不差，这是为什么？ 写到这，我头有点痛了，因为我没有办法证明；就是有人提供了证明，我暂时也看不到用途。毕竟，酶反应不是受单一因素影响的。如果说该思考有什么现实意义，那就是：残留蛋白质的危害可能被夸大；许多实验在重复失败，只是因为你抓住的嫌疑犯不是真凶。更大胆的假设是：BSA 可以用于某些核酸抽提，以更彻底去除与酶同源的蛋白质残留。 g：无介质的核酸抽提裂解液 (不含苯酚) 的展望 (供核酸抽提产品生产商及潜在的生产商参考) 经典的醇沉淀和洗涤，在无介质核酸抽提技术中，几乎是不可或缺的，尽管微调可以带来一些意想不到的效果。能展望的，也只有裂解液了。现在的裂解液，都没有同步去除蛋白质的功能；蛋白质的去除，或者靠裂解后再加入苯酚抽提去除蛋白质，或者靠加入高盐溶液去除蛋白质，效果也不错。能做的改进，看起来也就只有配制出这样一种裂解液：裂解效率高 (得率的保证)，同时蛋白质可以靠离心去除(操作简化了)。简单地讲，下面提供的是目前可以想象的结合有高得率、高纯度、操作最简单诸多特点的操作步骤 (以细胞为例。组织捣碎后也适用)： 在样品中加入裂解液，混匀后，静置使裂解彻底。高速离心后，蛋白质沉淀在离心管的底部，上清则为核酸。将上清转移到预先已经加入了醇的离心管中，轻轻混匀后，用一个小钩捞出大的絮状沉淀 (以DNA 为主) 到另外一个离心管中；捞不起来的 (主要是 RNA) 用离心沉底。分别洗涤蛋白质沉淀，DNA絮状沉淀和 RNA 离心的沉淀，再分别溶解，就可以同步获得 DNA/RNA/蛋白质了。 h：醇沉淀– 从低浓度核酸沉淀条件的改变看核酸是如何形成沉淀的 核酸醇沉淀的原理，按照分子克隆中的描述，是用阳离子中和了磷酸根的负电荷后，核酸“无性”结合才能沉淀下来。低浓度核酸沉淀的条件一般要做如下改变：使用长时间的低温、使用更高比例的醇、使用 tRNA 之类的东西。下面就用 Flash 语言的特点，描述一下“无性”的核酸是如何结合的。 溶液中的单个核酸，虽然是“无性”的，对其它的核酸，仍然是有引力的(大小与距离相关)；同时，核酸分子受到的另外一个力，来自分子运动。在一般情况下，核酸之间的引力比分子运动产生的力小许多；只有当核酸之间的距离足够近时，引力才能克服分子运动产生的力，使两个核酸结合到一起。结合在一起的两个核酸又共同对其它的核酸产生引力(该引力比单个核酸的要大)，结合上更多的核酸 … 最终沉淀下来了。低温和更高浓度的醇都有利于降低分子运动产生的力，tRNA能提高总核酸浓度进而通过与目的核酸的结合提高了目的核酸之间的引力，所以低浓度核酸的沉淀条件如上。至于 2价镁离子有利于低浓度核酸的沉淀原因，可能是镁离子要被同一核酸分子的两个磷酸根结合，这种结合的结果是核酸分子变得更立体了（团状）：引力越集中，对外就越大。 i：从柱离心式产品的流行看经典方法的缺点 （或者操作重点） 柱式方法的风行是无法否定的现实。下面通过柱式方法与经典方法的比较，看一看如何注意经典方法的操作重点。 裂解，二者几乎没有任何区别。去蛋白质，柱式靠的是柱材料对蛋白质吸附力低这一特点，将蛋白质残留控制在比较低的水平(并不是/也不能彻底去除)；经典方法最常用的是 PC 抽提，可以将蛋白质去除得更彻底一些。其它大分子杂质 - 如多糖等 -的去除，柱式的与蛋白质的去除相似，但经典方法中却没有如此方便的对应方法。小分子物 (盐等)的去除，在我的眼里，是柱式方法最可爱的地方。如果柱子设计没有问题，离心后柱子中残留的液体稳定而少；柱式的洗涤具有“流水洗涤”的效果；柱式中的核酸是不成团块的 - 这三个特点决定了柱式的洗涤效率比经典的洗涤效率高，所以，柱式纯化的核酸纯度比较高。 结论是：裂解和去蛋白质的能力，经典方法不次于柱式方法；去除其它大分子杂质，经典方法不如柱式；洗涤能力，按目前各种参考书中的介绍去做，几乎没有办法超过柱式方法。你看一看上面柱式方法洗涤的特点，经典洗涤方法哪一条强调了。再想一想你是如何手工洗衣服的，象不象柱式洗涤的特点，就应该不会有疑问的吧。难道过去的核酸沉淀洗涤方法有错误？那倒不是。真正的原因是，过去核酸抽提使用的小分子物(盐等)，多是后续酶反应中会使用到的或者起码少量的残留不会抑制后续酶反应的；现在抽提中使用的东西就不一样了，都是一些对蛋白质有强烈作用的东西，而且浓度还非常高。过去有资料强调测 A230 值吗？自Guanidine Thiocyanate 开始广泛用于核酸抽提后，A260/A230比值的测定成为检测质量标准的一个非常重要的指标了。 如果将洗涤操作更强化及严格一点，对于一般比较干净的样品，你会发现经典方法抽提的核酸完全可以达到非常好的质量的。柱式就还留下一个“快”的特点，当然应该说是“更快”。 有一个无心插柳的结果供分享：加入醇沉淀基因组 DNA时，将沉淀挑到另外一个离心管中，挑不起来的离心使之沉淀；同样洗涤/干燥/溶解后，同时电泳。电泳显示：离心沉淀的加样孔几乎无荧光，20kb左右有一条亮带；挑出来的加样孔荧光非常强烈，从加样孔到 20kb 之间有弥散带，但没有清晰的主带。 [search]核酸抽提问题[/search] |
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