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tanwuping

新虫 (初入文坛)

[求助] 转基因植株RT-PCR检测

转基因洋葱T0带PCR检测出颗阳性植株（经两对引物检测有目的条带，且没有非特异条带），提取RNA做RT-PCR检测时，均没有出现目的条带，但是有一条非目的条带，按理说不应该出现非特异条带啊，求大神指点，如何解释。
转基因植株RT-PCR检测
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1楼 2013-12-27 10:21:58
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世外清风

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

扩增的是哪一部分啊，PCR扩增是DNA片段可能包含了启动子等原件，RNA水平是肯定扩不出来的，还有转基因检测你就1条引物检测，可能出现假阳性，多设计几对检测。
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2楼2013-12-27 15:09:42
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tanwuping

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 世外清风 at 2013-12-27 15:09:42
扩增的是哪一部分啊，PCR扩增是DNA片段可能包含了启动子等原件，RNA水平是肯定扩不出来的，还有转基因检测你就1条引物检测，可能出现假阳性，多设计几对检测。

我用了两对引物啊，我上面说清楚了。DNA的PCR和RT-PCR都是用的两对引物。上面的图片是RT-PCR的结果，上面一排是一对引物，下面一排是另一对引物。引物设计的是从启动子之后的一段序列，转录不就是葱启动子开始吗？mRNA应该是启动子到终止子的序列，为什么RNA水平阔步出来？求大神指点
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3楼2013-12-27 22:36:44
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世外清风

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by tanwuping at 2013-12-27 22:36:44
我用了两对引物啊，我上面说清楚了。DNA的PCR和RT-PCR都是用的两对引物。上面的图片是RT-PCR的结果，上面一排是一对引物，下面一排是另一对引物。引物设计的是从启动子之后的一段序列，转录不就是葱启动子开始吗？ ...

当然不是啊，mRNA水平当然扩不出来啊，其实位置在启动子中只占很小一部分，启动子主要是转录因子和转录元件的结合部位，起始位置很靠后了。还有RT检测都扩出来要排除两个：第一，扩出来是你要的带吗（可以测序验证），第二，其内源有这个基因吗？有的话都扩出来很正常啊。
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4楼2013-12-28 16:49:20
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tanwuping

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 世外清风 at 2013-12-28 16:49:20
当然不是啊，mRNA水平当然扩不出来啊，其实位置在启动子中只占很小一部分，启动子主要是转录因子和转录元件的结合部位，起始位置很靠后了。还有RT检测都扩出来要排除两个：第一，扩出来是你要的带吗（可以测序验证 ...

扩出来的不是我要的目的条带，DNA都没有非特异条带，RNA怎么可能出现非特异（无法解释）。我的前引物是从启动之后（超过400bp），ATG之前60bp的位置开始，后引物在目的基因上。这样出不来？
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5楼2013-12-28 17:56:56
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tanwuping

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 世外清风 at 2013-12-28 16:49:20
当然不是啊，mRNA水平当然扩不出来啊，其实位置在启动子中只占很小一部分，启动子主要是转录因子和转录元件的结合部位，起始位置很靠后了。还有RT检测都扩出来要排除两个：第一，扩出来是你要的带吗（可以测序验证 ...

不是我要的目的条带。我DNA都没有非特异条带，这个怎么会出非特异（内切造成概率也几乎不可能）。我的前引物是从启动之后（超过500bp），ATG之前60bp的位置开始，后引物在目的基因上。这样扩不出来？？？
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6楼2013-12-28 17:59:13
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世外清风

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
6楼: Originally posted by tanwuping at 2013-12-28 17:59:13
不是我要的目的条带。我DNA都没有非特异条带，这个怎么会出非特异（内切造成概率也几乎不可能）。我的前引物是从启动之后（超过500bp），ATG之前60bp的位置开始，后引物在目的基因上。这样扩不出来？？？...

没有目的条带有非特异性带就不要纠结了，换引物吧，引物不行啊，扩增出现非特异性带很正常的，就是引物不行，换引物吧
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7楼2013-12-28 22:01:11
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tanwuping

新虫 (初入文坛)
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7楼: Originally posted by 世外清风 at 2013-12-28 22:01:11
没有目的条带有非特异性带就不要纠结了，换引物吧，引物不行啊，扩增出现非特异性带很正常的，就是引物不行，换引物吧...

8楼2013-12-29 09:33:44
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gxhnty

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引物特异性不强，非特异扩增，重新合成引物。
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金币金币金币，统统拿走，拿走，拿走.........
9楼2013-12-30 15:07:24
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