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applepie119

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[交流] 真核细胞表达外源基因步骤

真核细胞表达外源基因步骤

      在真核细胞中表达蛋白的步骤比大肠杆菌复杂得多。首先要考虑选用什么载体。一般人们趋向于使用分泌表达载体，以便于蛋白的纯化。但有的蛋白并不适合于分泌表达，如一些胞质蛋白，非糖基化蛋白等。此外分泌表达的蛋白信号肽存在一个效率问题。有的蛋白即使存在信号肽，也不能分泌。并且有的分泌蛋白较易受到蛋白酶的降解。所有这些因素都需综合考虑。
1 克隆
      选用合适的内切酶把外源基因克隆于表达载体的多克隆位点。如果选用的是分泌型表达载体，则外源基因的阅读框架和信号肽的阅读框架应该保持一致。
2 重组栽体线性化
      重组载体只有被酶切线性化整合效率才能大大提高，环状质粒整合效率是很低的。选用不同的内切酶线性化可得到不同的转化子。如对载体
pPC19选用BgiⅡ线性化，转化后可得到Muts表型转化子；选用SaI或StuI线性化，转化后可得到Mut表型转化子。
3 转化
      目前对真核细胞的转化方法有多种，例如对于P.Pastoris的转化目前有4种方法：①锂盐法；②PEG法；③原生质球法；④电穿孔法。锂盐法和PEG法方法简便，但效率很低，每微克DNA只有几十个转化子或更低，一般不多用。原生质球法和电穿孔法转化率都较高，而且一般可得到高拷贝重组，其转化率都可达到105/μg。但原生质球法操作繁琐费时；电穿孔法简便、快速、高效，是理想的转化方法。选用上述四种方法中的一种转化。一般选用原生质球或电击法。
4 筛选
      转化子可先在不含组氨酸的培养基上初筛。复筛可用PCR进行。即提取转化子DNA，用外源基因两侧特异引物扩增筛选。然而，这只限于少量转化子转化子太多，则工作量太大。对于大量转化子的筛选．可用原位点杂交进行。即把相同量的不同转化子点在NC膜上，在原位对酵母细胞壁进行裂解，使之释放DNA。DNA经变性、中和后，可和由外源基因制备的探针杂交。用这种方法，在一张Nc膜上，可完成对几百个转化子的筛选。用原位点杂交不仅可以筛选大量转化子，而且可以鉴定多拷贝。这是因为当点到NC膜上的菌量相同时，转化子中外源基因拷贝数越多，则杂交后信号越强。
5 鉴定表型
      筛选出的转化子需鉴定表型，以酵母为例，即确定是Mut+还是Muts。这两种不同表型在诱导表达的条件上有差异。可以把转化子同时点在MD和MM 两块板上。在MD和MM板上生长差别不大的转化子为Mut+；相反，在MD上生长快，MM上生长很慢的转化子为Mutd。
6 诱导表达
      外源蛋白在真核细胞中的表达分两步，即菌体生长和蛋白诱导表达。先在以培养基上培养菌体，达到一定OD值后，离心弃上清，菌体悬浮于以液体培养基中诱导表达。表达的条件有待优化，如通气状况，pH值，培养基的组成等等。一旦最佳条件确定，则可以按比例放大。从摇瓶培养转至大规模发酵

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1楼 2007-12-29 16:00:02

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1. pCMVp-NEO-BAN载体
      特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322 骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
      插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。

2. pEGFP,  增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)
      特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
      用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
      亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。
      Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507

      图示为启动子分泌信号肽和多克隆位点区域：

      Ase1.pCMV…ccg cta gcg cta ccg gtc gcc acc atg- .EGFP…BamH1…SV40 poly A+
      Nhe1       Age1

3.  pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体
      特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
      用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。
      Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507

      图示为启动子和多克隆位点区域：
      pCMV….Nhe1….Age1….EGFP…Bgl11…Actin…BamH1…SV40 poly A+

4. pSV2表达载体
      特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。

      图示为启动子和多克隆位点区域：
      Pvu11…pSV40….Hind111….SV40 IVS….SV40 polyA+

5． CMV4 表达载体
      特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。

      图示为启动子和多克隆位点区域：
      CMVp…Bgl11…Kpn1…Mlu1…Cla1…Hind111…Xbal1…Sma1…GH…….SV40 ori
      其他常用克隆Vector：
      pBluscript II KS DNA    15 ug
      pUC18 DNA             25 ug
      pUC19 DNA             25 ug
      说明:
      pBluescript II kS、pUC18 & Puc19载体适合于DNA的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等。这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点，当外源DNA扦入，转化lacZ基因缺乏细胞，并在含有IPTG和X-gal的培养基上培养时，含有外源DNA载体的细胞将为白色菌落，而无外源DNA载体的细胞则为兰色菌落，由此易于筛选有无外源DNA的载体。此外，这些载体中有便于测序的M13、T7和T3的通用引物进行DNA测序。
      保存液: TE Buffer
      TE Buffer组成:
      10 mM Tris.HCL(Ph 8.0)