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danfoerliu

[交流] 多糖的研究发展

1 多糖背景

多糖是生物体内一类重要的大分子，除了储存能量和支持结构外，还是一类重要的信息分子，在生物体内起着信息传递的功能。近年来，人们发现一些多糖如香菇多糖、云芝多糖、茯苓多糖能够治疗免疫系统受到损伤而引发的一些疾病，无毒副作用，是一类有很大开发潜力的免疫调节剂，特别是多糖的一些衍生物，如硫酸酯化多糖，具有抗肿瘤和抗病毒的活性。为此，多糖在医药方面的应用渐渐引起人们的兴趣。                 

越来越多的研究证明:多糖是非特异性的免疫调节剂(生物效应调节剂BRM),它主要影响网状内皮系统（RES)、巨噬细胞(MΦ)、淋巴细胞、白细胞以及RNA、DNA、蛋白质的合成,cAMP(环化腺苷-磷酸)与cGMP(环化鸟苷-磷酸)的含量,抗体的生成、补体的形成以及干扰素(IFN)的诱生,并具有抗肿瘤、抗炎、抗凝血、抗病毒、抗放射、降血糖、降血脂等活性。随着研究的深入,多糖在医疗上的价值越来越重要,新的用途不断被发现。此外多糖在日用化妆品方面,在食品工业、发酵工业及石油工业等行业上也有着广泛的应用。

多糖来源很广,大多来源于高等植物、细菌、真菌、地衣和海藻等,在生药中尤其丰富。真菌多糖研究较早,进展较快,且已开始在临床上用于癌症的免疫治疗。随着药品专利的实施及我国申请加入世界贸易组织,医药部门的科研、生产和管理都面临着新的挑战。药品作为特殊的商品,必须纳入国际市场,参与国际市场的激烈竞争。我们必须逐步开展有独创性、有竞争力和全新的药物研究与开发,这就要求充分挖掘利用我国的资源优势。从真菌中提取生物活性多糖,充分反映了利用这类资源的潜力。

2 多糖的提取分离、分离、纯化

2.1多糖的提取

动植物及微生物多糖，首先要去表面脂肪。原料经粉碎后加人丙酮、乙醚、乙醇、甲醇或1:1的乙醇乙醚混合液，水浴加热搅拌或回流1～3小时，脱脂后过滤得到的残渣一般用水作溶剂提取多糖，温度控制在90～100℃，搅拌4～6小时，反复提取2～3次;也有的用0.1～1M氢氧化钠或氢氧化钾碱性水液、氯化钠水液、1%的醋酸和1%苯酚作为提取溶剂。得到的多糖提取液大多较粘稠，可进行吸滤，也可用离心法将不溶性杂质除去，将滤液或上层清液合并，若为碱溶性多糖则需中和。合并的多糖提取液经浓缩后，加人2～5倍低级醇(甲醇或乙醇)沉淀多糖;也可加人费林氏溶液或硫酸钱或嗅化十六烷基三甲基按等，使与多糖物质结合生成不溶性络合物或盐类沉淀。然后依次用乙醇、丙酮、乙醚洗涤，将吸干后疏松的多糖迅速转人装有五氧化二磷/氢氧化钠的真空干燥器中减压干燥。若沉淀的多糖为胶状或具粘着性时可直接冷冻干燥。干燥后得粉末状粗多糖。

2.2多糖的分离、纯化

    提取的粗多糖中通常含有一定量蛋白质、色素、低聚糖等杂质，应当除去。   

2.2.1除蛋白质

    (1) Sevag[1]法:根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，用氯仿:戊醇(或正丁醇)5:1或4:1，混合物剧烈振摇20到30分钟，蛋白质与氯仿一戊醇(或正丁醇)生成凝胶物而分离，离心，分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。此种方法在避免降解上有较好效果，但效率不高，如能配合加人一些蛋白质水解酶，再用Sevag法效果更佳。

    (2)三氟三氯乙烷法[2]:按多糖溶液:三氟三氯乙烷1:1加人，在低温下搅拌10分钟左右，离心得上层水层，水层继续用上述方法处理几次，即得无蛋白质的多糖溶液。此法效率高，但溶剂沸点较低，易挥发，不宜大量应用。

    (3)三氯醋酸法:在多糖水溶液中滴加3%三氯醋酸，直至溶液不再继续混浊为止，在5~10℃放置过夜，离心除去沉淀即得无蛋白质的多糖溶液。此法会引起某些多糖的降解。

  2.2.2除色素

对于植物来源的多糖，可能含有酚型化合物而颜色较深，这类色素大多呈负性离子，不能用活性炭吸收剂脱色，可用弱碱性树树脂DEAE纤维素或DuoliteA一7来吸附色素;若糖与色素是结合的，易被DEAE纤维素吸附，不能被水洗脱，这类色素可进行氧化脱色:以浓氨水(或NaOH液)调至pH8.0左右，50℃以下滴加H2O2:至浅黄，保温2小时;发酵来源的多糖颜色一般较浅;对于动物，微生物等提取到的多糖也可根据不同情况按上述方法处理。一般情况下，尽量避免用活性炭处理，因活性炭会吸附多糖，造成多糖的损失。

2.2.3除低聚糖等小分子杂质

通过逆向流水透析除去低聚糖等小分子杂质。这样得到的就是多糖的半精品。

2.3多糖的纯化方法

2.3.1分部沉淀法[3] 常用的沉淀剂有甲醇、乙醇和丙酮。

2.3.2季胺盐沉淀法 常用的季钱盐是十六烷基三甲基钱嗅化物(CTAB)及其碱

(CTA－OH)和十六烷基吡啶(CPC)，实验时必须控制多糖混合液的pH小于9及无硼砂存在。

2. 3.3盐析法 常用的盐析剂有硫酸铵、氯化钠、氯化钾、醋酸钾等。

2.3.4金属络合物法 常用的络合剂有费林溶液、氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等。

2. 3.5柱层析

(1)纤维素柱层析:常用不同浓度乙醇水溶液由高而低进行洗脱，将各种多糖分离开来。

(2)纤维素阴离子交换柱层析此法:适用于分离各种酸性、中性多糖和粘多糖。用的交换剂为DEAE－纤维素和ECTEOIJA－纤维素。

(3)凝胶柱层析:常用的凝胶有葡聚糖凝胶(Sephadex)、琼脂糖凝胶(Sepharose)及DEAE－Sephadex。此法不适宜粘多糖的分离。展开剂为各种浓度的盐溶液及缓冲液，它们的离子强度最好不低于0.02[2]。

(4)亲和层析:用凝集素(一般是蛋白质和糖蛋白)作亲和色谱来分离多糖。

(5)高压液相层析[4]

1.3.6其他柱层析用活性碳及硅胶作载体的柱层来分离多糖;或用硼砂型的离子交换树脂分离中性多糖。

1.3.7超过滤法多糖溶液通过各种已知的超过滤膜就能达到分离[5]。

1.3.8制备性区域电泳载体通常是玻璃粉。

2.4多糖的纯度鉴定

2.4.1超离心法若多糖在离心场作用下形成单一区带，则表明该多糖是均一组分。实验时用此法须有分析用带照相设备的超速离心机。

2.4.2高压电泳法电泳后若呈单一色斑或单一峰则为均一组分多糖。

2.4.3凝胶柱层析若分部收集中出现形状对称的单一峰，说明该多糖为均一组分。常用的凝胶为Sephadex、Sepharose、Sephacryl，注意柱高与柱直径之比应大于40。

2.4.4旋光测定法如果不同浓度低级醇得到的多糖沉淀的比旋度相同，则证明该多糖为均一组分。

2.4.5高压液相法德国等常用高压液相法来检测多糖纯度，结果可靠｡必须指出:纯度检查一般要求有上述两种方法以上的结果才能肯定。

3 多糖的药理作用

1.植物多糖与抗肿瘤

1.1植物多糖的药理作用     

近年来，随着分子生物学的发展，人们逐渐认识到多糖与蛋白质、核酸一样，是涉及生命活动本质的三类生物大分子之一。面对植物多糖医药界的兴趣尤为浓厚，至今已报道了一百多种具有抗病毒、抗辐射、免疫调节、延缓衰老、抗肿瘤、免疫调节等多种生理活性的中药多糖，有的已在临床上被用于肿瘤、肝炎、心血管疾病的辅助治疗和康复。

1.1.1   抗病毒作用

    研究发现，从红藻中提取的红藻多糖能明显抑制牛免疫缺陷病毒BIV的生长。红藻多糖是多糖的衍生物硫酸化多糖。另外，云芝糖肽具有明显的抗乙肝病毒的作用。复制慢性乙肝患者口服云芝糖肽胶囊，HBeAg阴转率为40.0%，抗HBcIgM阴转率为46.7% , HBV-DNA阴转率为33.3%。

1.1.2   抗辐射作用

    研究者发现猪苓多糖对因受辐射而损伤的大鼠造血功能及免疫功能的作用结果表明，腹腔注射猪苏多糖对大鼠的造血功能和免疫功能抑制具有逆转作用，使因受辐射而损伤的大鼠有核细胞数、指数及NK细胞活性明显提高。研究还发现瓦茸多糖对辐射导致的小鼠脾脏损伤的恢复作用，小鼠受照后其脾脏及脾脏细胞的DNA合成速率下降，而瓦茸多糖对辐射导致的脾脏损伤有明显的修复作用，用60Cov－射线7.5Gy对NH小鼠进行一次性全身照射。结果表明，云芝提取液对60Cov－射线照射的小鼠有显著的保护作用。20世纪80年代，日本科学家成功地在云芝提取液中找到它的有效成分，这种有效成分就是一种含蛋白质及多糖的物质。

1.1.3   延缓衰老

    中医延缓衰老的保健药方多为补益类中药方剂，这些植物药中含量较多的成分为多糖。研究魔芋多糖(SKGM)的抗衰老作用。魔芋为天南星科多年生草本植物的块茎。实验用绞股蓝总苷（GY)作衰老对照，结果SKGM给药剂量仅为GY的四分之一即能达到与GY相当的效果。SKGM对老化相关指标的影响表现在对谷胱甘肽过氧化酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶及过氧化脂质的影响。而以上指标均与体内自由基有关，这提示SKGM抗衰老作用与清除体内自由基有关。通过研究油柑多糖对氧自由基活性的影明，结果表明，活性大小与多糖用量呈正相关。研究发现，肉苁蓉能延缓皮肤衰老，增加动物烃脯氦酸的含晕，使胶原纤维含量增加，改善皮肤弹性，激活超氧化物歧化酶，降低体内脂褐质的堆积在D-半乳糖甲哀小鼠模型中，分别注射淫羊藿粗多糖（EPS）和粗黄酮（EPF）使被抑制的T细胞和B细胞功能有明显恢复，且EPS较EPF作用略强；此外对肝脏脂质代谢产物MDA的积累有缓解作用，能使之回到正常水平；亦可使肝脂褐素色素沉积广明显改善说明在早衰实验动物中，淫羊藿可以延缓衰老的生化代谢障碍与免疫低下。枸杞子的主要有效成分为LBP－一种大分子多糖成分。研究证明，小剂量（lmg/kg.7d)LBP对老年小鼠衰退的胸腺细胞（丝裂原ConA)增殖转化反应有十分显著的增强作用。另外，何首乌、人参、黄芪、女贞子的多糖都有一定的抗衰老作用，而LBP抗衰老药理作用更为突出，对机体多种生理、生化功能的促进与调节作用较为全面。

1.1.4   抗肿瘤

    多糖可以防止化疗和放疗对肿瘤病人正常细胞的损伤。研究表明，极大螺旋藻胞内多糖对体外生长的U937细胞有助长作用，而对体外生长的HL-60细胞有抑制作用，提示极大螺旋藻胞内多糖对人的血癌细胞的生长有明显的影响。按常规接种肿瘤法，将瘤株接种至每只小鼠，然后给予羧甲基茯苓多糖口服液，连续给药一定时问后测瘤重，结果表明该口服液有显著的抑瘤作用，对S180瘤株的最高抑制率达64. 18%，对EAC瘤株的抑制作用亦非常明显，另外还使荷瘤小鼠的肿瘤坏死因子含量明显提高。给小鼠皮下接种RIF-1肿瘤细胞，单独给予昆布多糖硫酸酯（LAMS) ,结果肿瘤生长延迟2.6d；LAMS与四氢皮质甾醇合用，可使RIF-1肿瘤生长延迟4.8d;苯丙氨酸氮芥与LAMS联用，可使RIF-1肿瘤生长延迟6.1d，而单独应用苯丙氨酸氮芥仅能使RIF-1肿瘤生长延迟2.2d。研究红毛五加多糖（AGP)的体外抗肿瘤的机制，发现AGP有诱导肿瘤细胞SGC-7901凋亡的作用。

1.1.5   免疫调节作用

现代医学、细胞生物学及分子生物学的发展，使人们认识到免疫系统的紊乱不仅会产生多种疾病，而且与人体衰老及老年人多发病有关。艾滋病的危苦使人们对免疫缺损的严重后果有了更深刻的认识。科学家们发现，植物多糖最重要的药理作用为免疫促进作用。研究表明，牛膝多糖具有显著的增强机体免疫功能的作用，它能升高血清溶血数和脾脏内抗体形成细胞数，提高血清免疫球蛋白IgG水平，能激活网状内皮系统的吞噬功能，激活巨噬细胞促进干扰素(1NF)和白介素-2的生长，促进淋巴细胞的增殖，增强杀伤NK细胞和CTL细胞的活性。茶芎多糖能非常显著地拮抗环磷酰胺Cy所致的体液免疫抑制，使其恢复正常。另外，茶芎多糖（LP)能显著或非常显著地增加正常或Cy组小鼠的脾脏和胸腺的重量，说明LP能提高机体非特异免疫功能。从防风水提液中可得到两种酸性杂糖XC-1和XC-2, XC-2能显著提高小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖，因而有显著增强机体免疫功能的作用。黄芪多糖可显著提高小鼠抗体形成细胞的数量。体外培养C57BL小鼠，测定其对刀豆素A和细菌脂多糖的反应，结果显示，黄芪多糖存在时，脾细胞对刀豆素A的反应下降，而对细菌脂多糖的反应则升高,提示黄芪多糖在体外有抑制T细胞的反应，促进B细胞的作用另外还能纠正环磷酰胺对抗体形成细胞的抑制作用
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1楼 2007-12-27 16:08:46
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liu200479

木虫 (正式写手)

文献提醒：

还有问题，苯酚硫酸法误差的问题，单糖甘类在提取物中对总糖含量的干扰是否考虑到？
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3楼2007-12-30 07:04:52
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liu200479

木虫 (正式写手)

文献提醒：

文献过时了，
2.4.5，2. 3.5(3)，2.2.2
有问题或该更改不能全信
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2楼2007-12-30 07:01:44
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cat987123112

木虫 (职业作家)

逍遥谷谷主
能否把部队的地方指出来
以供大家参考
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为孩子不坐校车而奋斗
4楼2007-12-31 14:37:13
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liu200479

木虫 (正式写手)
2.4.5高压液相法德国等常用高压液相法来检测多糖纯度，结果可靠｡
这点也存在一点技术的细节问题：以前的普通高压液相柱的柱效较低三根串起来大于五千，现在也有单根柱柱效大于五千的，多糖的纯度关键在于在于选择高柱效液相柱的来证明其结果的可靠性，如果柱效不够，结果不一定可靠。
基础多糖柱分离需要注意的问题：
填充合理时，每米柱效的排序如下：
sephadexG1000〈Sepahcryl6000-8000〈superdex12000
你可以看文献（由于时间关系没传上来），用由于sephadexG柱效通常情况下是低于HPGPC的柱效，sephadexG分离的多糖在高压液相色谱HPGPC中往往不是对称峰，而Sepahcryl就好得多
例下图，国内一个比较粗心大意的研究生做的（如果样品溶解度大，不合并样品峰型会更好），是示差检测器的多糖样品峰【由于样品量少（合并Sepahcryl分离30次左右相同的样品的）】，HPGPC柱效大于5000，30-40min为多糖峰，倒s峰为溶剂峰，纯度就高一点。而用低柱效的sephadexG分离的纯度不一定好。

1必须指出:纯度检查一般要求有上述两种方法以上的结果才能肯定-随着分离手段和
就目前全世界最先进的分离多糖的水平只能把多糖分离到混合物。普通化合物必须用两种（三种）以上的溶剂系统来证明其纯度，不适合多糖。
多糖的纯度与分子量分布范围有关
多糖的分子量呈多分散性特点（分子量分布再一定范围内的混合物），例如上图的样品分子量分布20000-60000的多糖，多糖在质谱上也是分子量分布再一定范围内的混合物。我以前见过希望谁能传上来。
结论：
其实用分子量分布范围和分布宽窄而不是HPGPC上的单一对称峰来判断分离的纯度更有现实和应用意义，比如上市的香菇多糖分子量范围在四十万的药效较好，高或低出范围均会影响药效。

2.2.2 DEAE纤维素或DuoliteA一7来吸附色素，不一定适合结合多糖与色素结合的结合型多糖，由于色素与多糖结合，色素被吸附在色谱柱上同时多糖也被吸附在色谱柱上，容易造成多糖的损失。我最近做某种植物除蛋白后提取物，多糖含量在30%左右，上样1.5g结果，只剩0.2g样品被洗下来，有别的方法脱色损失的就地很多。除低聚糖等小分子杂质通过逆向流水透析除去低聚糖等小分子杂质，这样得到的就是多糖的半精品。这样得到的就是多糖的半精品-这个方法结果出现的可能性很多，纯在许多不定因素，如果除色素[特别强调在部分植物里存在的结合型色素，结合型色素特别难除而且很容易被忽视]和蛋白除得好的话，基本没有杂质，得到的多糖含量较高基本上都是多糖，可以叫总多糖。
但是如果如果除不净，多糖纯度较低有时不一定能达到半精品的要求。

2. 3.5(3)补充的：一定要注意流速，Sephadex， Sepharose，DEAE－Sephadex是软胶，流速过快能把凝胶填料压坏，就起不到分离作用了。
注意的离子强度过高，分离时间过长会导致凝胶结构变形，具体时间应该请教amersham的技术。
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6楼2008-01-02 08:53:52
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