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rzhdw铜虫 (小有名气)
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关于大肠杆菌彗星实验
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各位大侠，鄙人非生物专业，参照文献方法尝试了E.COLI的中性条件彗星实验，但在显微镜观察的时候发现荧光比较微弱，且细胞看起来只有一个小点，完全看不到文献中的那种拖尾的形状。不知道是不是我的显微镜不行？本人用的是莱卡DMRX，滤光片组H3, BP 420-490/RKP 510/LP 515, 照相机为Nikon DXM 1200F, 目镜10X, 物镜40X. 另外，文献中说SYTO9染料可能荧光强度不够，需要用YOYO-1染料。但是手头上没有，买又太贵了。。。有没有好心人可以交换的？我这里有Invitrogen Live/dead 荧光试剂盒。 附上实验流程： 1. 玻片预处理：用灭菌水（或0.85%生理盐水）配制1%常熔点琼脂糖溶液，加热溶解并冷至55度，将中间有透明窗口的磨砂玻片酒精浸泡并灼烧后，预热至55度，采用浸渍法涂板，60-70度干燥15min 2.第一层胶（选做）：0.85%盐水配制0.5%常熔点琼脂糖，加热熔融后55-60度保温，吸取200ul加入预处理的玻片上，盖上盖玻片，4度放置10min，移去盖玻片 3.第二层胶：琼脂糖同步骤2，取200ul琼脂糖与2ul 107cfu/ml 菌液混合，取100ul混合液加至第一层胶上，盖上盖玻片，4度放置10min，移去盖玻片 4.第三层胶：加入200ul常熔点琼脂糖，含有5 ug/ml RNase A, 1 mg/ml lysozyme，0.25% 月桂酰肌氨酸钠，上盖玻片，4度放置10min，37度培养30 min 5.裂解：裂解液为2.5M NaCL, 100 mM EDTA四钠, 10 mM Tris PH10, 1%月桂钠，实验前加入1% Triton X-100，室温搅拌至少10 min，将胶片浸入该溶液中室温裂解1 h。 6.酶消解：2.5M NaCL, 10 mM EDTA，10 mM Tris PH7.4, 1 mg/ml （或0.5-0.6 mg/ml）蛋白酶K(不含DNAse)，37度培养2h。 7.电泳：电泳液为300 mM 醋酸钠，100mM TrIs（PH 9）,胶片首先在该溶液中平衡20 min，12V电泳1h（0.4 V/cm, 100 mA）。将玻片先后浸入1 M醋酸铵乙醇溶液20 min（5 ml 10M 醋酸铵加入45 ml 无水乙醇），无水乙醇中30 min，70%乙醇10 min，室温晾干。 8.染色及观察：染色前胶片先吸取50ul新鲜配制的5% DMSO及10 mM NaH2PO4, 滴加至玻片上，在玻片还是湿润状态时加入50 ul 20uM SYTO 9 (in 5% DMSO), 用荧光显微镜观察，放大倍数400X,激发波长488 nm，发射波长510 nm. |
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