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serhhrr

铁虫 (初入文坛)

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[求助] 大片段PCR扩增求助已有4人参与

我需要做一个RTPCR,扩增未知目的条带，大小约为3000bp，循环体系如下：94℃ 30s，54-60℃ 30s ， 72℃ 3-4min。酶的话用过LA Taq，Taq酶都用过，也换人操作过，可一直P不出来，求助各位高手！！

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1楼2013-10-23 15:50:04

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凌波丽

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【答案】应助回帖

楼主的情况是长片段PCR不出现扩增条带。我刚刚根据楼主的情况写了一份参考资料，楼主可以参考。与所有的我过去回答过的常规PCR的问题与解答都不同。

长片段PCR不出现扩增条带的原因和对策

2013-11-10

　　PCR反应的主要的关键环节有:1.模板DNA的质量，2.模板DNA的长度过大，2.需要增加DNA聚合酶的专一性，3.缓冲溶液变质需要更换，3.引物的质量，4. 缓冲溶液，5. 引物，5.Mg2+ 浓度，6. Mg2+ 浓度，6.反应体积的改变，7. 反应体积的改变，8.物理原因，9.靶序列变异，10. 靶序列变异：11.长片段的变性、退火和延伸与常规PCR有所不同，一般要长一些，尤其是DNA聚合酶对于DNA单链的延伸时间。长片段PCR和普通PCR在不出现扩增条带的情况基本上是一样的。这里根据长片段PCR的情况写的，有些地方不适用于常规PCR。
　　
楼主的情况是长片段PCR不出现扩增条带，原因与解决方法如下：　　

下面是寻找原因并且针对上述环节进行分析原因与相应的对策，最后写出了调整顺序。　
　
一、原因及相应的对策：
1. DNA模板不纯，混入了杂质：(1)模板中含有杂蛋白质。(2)模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，此时A260/A280>1.8。(3)DNA模板溶液吸入了酚或者SDS。对策：重新提取DNA模板，去除蛋白质（比如：用Tris-HCl+饱和酚抽提DNA，DNA融于水相，同时变性沉淀蛋白质位于水相与苯酚相之间，可用吸管吸走变性沉淀蛋白质层，接着弃去苯酚相，最后用乙醇沉淀DNA）和小分子（透析、超滤等）。长片段PCR的模板用量一般是100pg-2ug。而且长片段PCR的DNA模板的纯度要求一般比常规的PCR要更一些，所以反应前应该充分提纯。

2. DNA模板发生了降解：反复冻融或者长期在冰箱的冷藏箱里，导致降解。使用凝胶电泳检验DNA模板是否存在降解，即有有明显弥散带出现。如果DNA模板存在降解则用为降解的DNA模板，或者重新提取DNA模板。

3. 需要增加DNA聚合酶的专一性。
现在已经有多种商用的长片段PCR的DNA聚合酶可以选择使用。首先选择质量好的商用的长片段PCR的DNA聚合酶。商用的长片段PCR的DNA聚合酶的添加剂不同于常规的PCR，一般不添加BSA，而加入30-100mmol/L的二甲基亚砜，100-150mmol/L的甘油，50-150g/L的PEG6000, 50-150mmol/L的甲酰胺，约5ug/L的大肠杆菌DNA单链结合蛋白，10-100mmol/L的氯化四乙铵，约0.1g/L的明胶等，每次加一种，别都加进去。也可以根据试剂盒的商业说明操作加入添加剂。注意加入时分梯度进行。
　　　
4. 缓冲溶液：最好都是新配置的，类别浓度要正确别加错了，这步可能是太基本很不被注意。
　
5. 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：(1)选定一个好的引物合成单位。(2)引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，需要调整引物的浓度，在反应时加入浓度基本相同的引物。(3)引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。(4)引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。（5）在引物的Tm范围内，选择较高的复性问题可以大大减少引物与模板的非特异性的结合，提高PCR反应的特异性。（6）引物3’末端用GC可以增加PCR的专一性扩增。　
　　　
6. Mg2+ 浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。Mg2+ 浓度一般可能与的dNTP浓度存在同方向偶联效应。如果是长片段PCR，更不同的产品试剂盒对于Mg2+ 浓度进行调整。
　　在长片段PCR中Mg2+ 浓度一般比常规的Mg2+ 浓度高，一般是2-6mmol/L，可以分梯度调整。也有高达10mmol/L和低至1mmol/L的，可以根据试剂盒的商家说明加以梯度调整。　　

7. 反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20μL、30μL、50μL或100μL，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20μL 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。具体反应体积根据长片段PCR试剂盒的说明确定。
　　　　
8. 物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。没有重新设计引物，不要大范围地变动反应体系的复性温度，要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。　　
　　
9. 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。这需要重新设计引物。

10.长片段PCR适宜使用热启动或者降落PCR。

11.长片段的变性、退火和延伸与常规PCR有所不同，一般要长一些，尤其是DNA聚合酶对于DNA单链的延伸时间。DNA聚合酶的延伸时间大致根据每分钟1000bp的聚合酶的速率来计算后确定，要保证每次延伸时间都够DNA聚合酶完全聚合完毕DNA单链。
一般三阶段热循环法的温度和时间为：92-97度需时间15 s-1min,60-67度需时间约1min，68-69度需时间约5-20 min。共循环25-30次。
首次变性温度和时间为：93-94度，2min，终末延伸温度和时间：68-69度，需时间约7 min.
具体参数根据具体的长片段PCR试剂盒的要求而作具体调整。