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真核转染不成功
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最近，我将500、700、1000bp长的蛋白分别克隆到sigma公司3*flag的CMV载体上（6kb多），然后用Roche公司的HP分别转染这三个表达载体到293T细胞（按照网上提示转染时没有换液且培养液中没有双抗）。这三个表达质粒是通过小提后再通过酚氯仿抽提，最后70%乙醇洗，然后测其浓度，都达到1微克/微升，且A260/A280都在1.8-1.9之间。转让后48h收集细胞，然后用sigma的RIPA裂解液100微升，裂解5min，同时加了PMSF和蛋白酶抑制剂，5min后加loading buffer煮。一抗用的sigma的抗flag，二抗用的D800，最后扫胶，发现都没有目的条带，都有一些非目的条带出现。原因是什么？ 20130930-h140.jpg |
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2楼2013-10-12 17:25:17
【答案】应助回帖
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建议western加阴阳对照先把这个程序排查一下， 然后把抽提的质粒上个胶看看，大小对不对，有没有开环，上样孔周围亮不亮。 转染的话你试试找别人要个质粒转个实验室转过的基因看看你的转染是不是做的有问题。 我个人的经验，转染用质粒的纯度很重要。不过楼主酚氯仿又抽了一遍感觉应该问题不大。如果真核养得好的话，很可能是上面两个实验的问题 |
3楼2013-11-01 05:57:15