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shiyanrui(金币+5,VIP+0):谢谢
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用考马斯亮蓝法 标准蛋白质溶液 称取牛血清蛋白10mg，溶于蒸馏水中定容至100ml 考马斯亮蓝G-250试剂 称取100mg考马斯亮蓝，溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（m/v）的磷酸100ml，用蒸馏水定容至1000ml 然后做标准曲线 管号 1 2 3 4 5 6 标准液ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水ml 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 G-250 5 5 5 5 5 5 含量ug 0 20 40 60 80 100 取6支具塞试管，编号后，加入以上试剂 放置2min后在595nm波长下比色测定（比色测定在1h内完成）以牛血清蛋白含量ug为纵坐标，绘出标准曲线 样品测定 1.称取样品适量（看你样品中蛋白的含量可以先少取一些200mg左右）加蒸馏水5ml放在冰浴上研磨成匀浆。离心（6000r/min 10min）将上清液倒入10ml容量瓶中，再向残渣中加2ml蒸馏水，离心10min，合并上清液，定容至刻度 2.另取一支试管，准确加入0.1ml样品提取液，再加入0.9ml蒸馏水，5ml考马斯亮蓝G-250充分混合，放置2min，以标准曲线1好试管做参比，在595nm波长下比色，记录吸收度 结果计算 代入标准曲线算出蛋白质的量 如果你测得的值比较大可以稀释以后再测，不过你要记好稀释的倍数哦！ |
12楼2007-12-04 18:40:22
2楼2007-12-02 19:37:54
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shiyanrui(金币+8,VIP+0):谢谢～！
shiyanrui(金币+8,VIP+0):谢谢～！
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蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。 Bradford法的突出优点是： （1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。 （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。 （3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。 此法的缺点是： （1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 （2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。 （3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。 |
3楼2007-12-02 19:39:12
4楼2007-12-02 19:40:49
