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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 那个蛋白怎么跑成这样了？
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Netherland

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 蓝冰天山 at 2013-10-07 19:12:28
上样量太大，减少上样量试试，如果是沉淀的话，是不是没有离心？

跑得上清  上样量已经很低了20ul
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11楼2013-10-07 19:57:01
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蓝冰天山

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by Netherland at 2013-10-07 19:57:01
跑得上清  上样量已经很低了20ul...

20ul不算少了，我们最多也就20ul，上个10ul试试，或者跑个梯度看看是不是上样量的问题。看其他条带还好应该不是胶的问题

[ 发自小木虫客户端 ]
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12楼2013-10-07 20:18:45
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by Netherland at 2013-10-07 19:55:46
跑了两次  胶也是重新做的  还是跑成这样  点样前都会沸水加热3分钟的...

1.样品应该充分溶解：保持各种蛋白质样品和Marker在上样前能够充分溶解，上样前最好离心一下，实在溶解不掉的颗粒就去掉。
2.SDS电泳带变宽，SDS电泳带与邻近蛋白质电泳相连。除了上样量过多和样品溶解不完全外，凝胶的加样孔泄露会使得电泳带变宽。加样孔泄露往往由于凝胶与玻璃板之间产生裂纹引起。对策：此时只能重新制备凝胶，梳子拔起时要小心等凝胶凝聚完毕，速度不宜过快，拔起的方向要垂直于凝胶表面；要避免凝胶两侧的玻璃板与凝胶之间产生裂纹，在凝胶制备过程中不要挤压凝胶两侧的玻璃板。
-----------这两条你并没有改进...这和你跑电泳的次数无关。

更正4楼：沸水浴是100度，不是110度。
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13楼2013-10-07 21:16:55
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你这是15%以上浓度的胶跑诱导表达15kDa左右的蛋白吧?
我觉得这太正常不过了~~~~我跑小于15kDa的蛋白从来都是这鬼样子
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
14楼2013-10-07 21:51:03
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by Netherland at 2013-10-07 19:53:08
可是上面部分条带显示浓度较低啊...

即使上面的条带浓度低，如果下面的浓度过高也会造成这种现象。这也是为什么经纯化的蛋白的上样量要比粗提少很多的原因。
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15楼2013-10-07 23:05:53
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2008101111

金虫 (正式写手)

学术江湖混子

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
样品蛋白浓度过高，甚至出现不溶的蛋白颗粒，建议上样前加热后离心，同时稀释样品
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自主创业者，捣腾生物试剂
16楼2013-10-08 15:00:47
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RUI1990

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
蛋白量过大就会出现上面的情况，将其稀释一下再试试。
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做自己
17楼2013-10-08 15:14:03
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ndsc

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
包涵体？样品浓度？还是标准品上太多了？！
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18楼2013-10-08 17:40:21
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剑客心语

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

应该是上样量过大的原因，将样品稀释一下试试，我一般上样5~10ul。
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一柄驻剑，一朝旅人，一颗常心，一生志言……行疆漫漫，品味一生……
19楼2013-10-12 16:24:13
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Allen206

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

蛋白溶解buffer是什么？目标浓度多少？不要煮沸试一下，换成tricine page try try
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不想说什么，，，，
20楼2013-10-12 16:46:33
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