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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 转基因 » 质粒构建一个氨基酸位点突变
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华农夏田

铁虫 (正式写手)

[交流] 质粒构建一个氨基酸位点突变

请教各位：本人分子生物学半文盲一枚，构建了真核表达质粒，测序后发现色氨酸密码子突变为精氨酸了，重复测序结果均为该位点突变，BLASTP比了，没有物种（人、老鼠）该位点发生突变，要做点突变的话估计有点难度额！多重PCR会不会效果比较好呢？还是继续往下做？迷茫！
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1楼 2013-10-02 15:37:00
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sylar1022

铜虫 (初入文坛)
★
华农夏田(金币+1): 谢谢参与
做个点突变变回来不就行了?-_-||

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2楼2013-10-02 17:34:09
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华农夏田

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sylar1022 at 2013-10-02 17:34:09
做个点突变变回来不就行了?-_-||

有建议重新合成引物做套式PCR，没做过啊
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5楼2013-10-02 18:12:51
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sylar1022

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 华农夏田 at 2013-10-02 18:12:51
有建议重新合成引物做套式PCR，没做过啊...

你片段很长么?-_-||做个点突变变回来就行了吧…载体很大?

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6楼2013-10-02 18:23:08
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sylar1022

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 华农夏田 at 2013-10-02 18:12:51
有建议重新合成引物做套式PCR，没做过啊...

做点突变跟有没物种有那个突变有什么关系?-_-||

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7楼2013-10-02 18:23:58
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华农夏田

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by sylar1022 at 2013-10-02 18:23:08
你片段很长么?-_-||做个点突变变回来就行了吧…载体很大?
...

片段750bp,载体5400bp，我们实验室都没做过点突变啊！
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9楼2013-10-02 19:41:52
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sylar1022

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 华农夏田 at 2013-10-02 19:41:52
片段750bp,载体5400bp，我们实验室都没做过点突变啊！...

就是在突变位点设带正确位点的引物往两边括增… 片段那么短，pcr突变很小可能吧，不是高保真酶么？重新pcr一次做吧…难道你模板就突变了?换个模板或者测下序

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10楼2013-10-02 21:25:12
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华农夏田

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by sylar1022 at 2013-10-02 21:25:12
就是在突变位点设带正确位点的引物往两边括增… 片段那么短，pcr突变很小可能吧，不是高保真酶么？重新pcr一次做吧…难道你模板就突变了?换个模板或者测下序
...

重新设计了一对引物，在突变位点两侧延伸十个碱基左右，这样应该是可以了吧？用两对引物来P！
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12楼2013-10-04 16:58:21
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华农夏田

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by sylar1022 at 2013-10-02 21:25:12
就是在突变位点设带正确位点的引物往两边括增… 片段那么短，pcr突变很小可能吧，不是高保真酶么？重新pcr一次做吧…难道你模板就突变了?换个模板或者测下序
...

做了一星期了，重叠三轮pcr,但是最后一轮就是不见条带，不管加不加全长引物，还真奇怪！
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13楼2013-10-20 12:52:06
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华农夏田

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 华农夏田 at 2013-10-20 12:52:06
做了一星期了，重叠三轮pcr,但是最后一轮就是不见条带，不管加不加全长引物，还真奇怪！...

设计突变位点两端各10个bp的上下游正确碱基互补引物，因为gc含量高所以氨基酸发生了突变，不得以才想做这个突变的，这下还是整不出来，急！
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14楼2013-10-20 13:03:11
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唐美霞123

新虫 (初入文坛)
可以查些文献做些点突变
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15楼2013-10-20 16:12:08
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华农夏田

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 唐美霞123 at 2013-10-20 16:12:08
可以查些文献做些点突变

看了撒，按照分子克隆overlappcr原理做的额，是不是突变引物太短了呢？谢谢！
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16楼2013-10-20 16:18:04
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youxi23楼
2013-10-02 17:48   回复  
华农夏田(金币+1): 谢谢参与
流水有情4楼
2013-10-02 17:59   回复  
华农夏田(金币+1): 谢谢参与
求不重复8楼
2013-10-02 19:01   回复  
华农夏田(金币+1): 谢谢参与
yingying158811楼
2013-10-02 21:29   回复  
华农夏田(金币+1): 谢谢参与
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