| 查看: 216 | 回复: 1 | ||
| 当前主题已经存档。 | ||
| 【悬赏金币】回答本帖问题，作者heshaoboli将赠送您 20 个金币 | ||
heshaoboli木虫 (小有名气)
城市农村
|
[求助]
cDNA文库构建求助
|
|
|
鱼类cDNA文库构建求助 各位高人好: 我把我们实验的大概情况说一下:去年师姐建库时用的试剂盒是用oligdT做引物反转录合成第一链,在给双链DNA加接头时加的是单一的EcoRI接头,与载体连接.没做出来,她又换了实验思路.还是没做出来， 所以现在由我们来做.存在的问题如下： 第一： 没有试剂盒,以前的试剂盒用完了，没出结果，不太可能再让买了。建库要用的酶购自俩家公司,上海生工和TaKaRa（用的时候按酶说明书上的体系和操作，这样的话酶来自不同公司，影响大不大？） 第二：实验思路也要自己设计,我们的实验思路如下: 1、提取总RNA 2、用oligdT-衔接子（衔接子里酶切位点想加BamHI的，除了酶切位点以外的其他序列怎么设计？）反转录合成cDNA第一链。 3、合成第二链，末端补平 4、加单一的EcoRI接头（序列：5-AATTCCGTTGCTGTCG-3 3-GGCAACGACAGC-5-P）有没有必要做PCR验证接头是否加上？ 5、去残余接头 6、用EcoRI接头引物（5-AATTCCGTTGCTGTCG-3，这个引物合适吗？）和oligdT-衔接子引物（此处引物怎么设计？如果完全跟oligdT-衔接子一样，这个引物会好长的啊）做PCR，预P出接头与衔接子之间的cDNA序列。（我们自己对这步设计不放心，因为看文献他们用的是Cassette Adaptor，我不知道我们在这里用EcoRI接头行不行） 7、将PCR产物直接与T载体连接。（PCR产物在与T载体连接前要不要纯化？） 8、转化，蓝白筛选。 第三：以前跟师姐做实验常遇到的问题有： 1、反转录产物太短，最近做的一次都在1Kb以下，以前做的集中在1Kb-2Kb之间。（我们以前温育的部分是在水浴中做的，最近那次是在PCR仪里做的，跟这个有关系吗？还是我们操作的问题？） 2、合成第二链后片段更短了。 3、蓝白筛选时很少长蓝斑，但白斑中一个阳性克隆都没验证出来。菌液PCR的结果是弥散的条带，有的甚至从点样孔的地方就有弥散。酶切质粒也没切出目的片段。（转化时我用空白质粒做对照，长出大量蓝斑，能否排除感受态细胞有问题？）（我师姐当时也设计了oligdT-衔接子，接头引物和oligdT-衔接子引物是她自己设计的，是不是引物设计的不合适造成了菌液PCR时出现弥散条带？） 我们现在面临的问题很多，极其希望得到各位高人的指点。先谢谢了！ |
回复此楼» 猜你喜欢
323求调剂
已经有6人回复
-
一志愿北京化工大学 070300 学硕 336分 求调剂
已经有4人回复
-
352求调剂
已经有3人回复
-
一志愿东华大学化学070300，求调剂
已经有8人回复
-
277材料科学与工程080500求调剂
已经有7人回复
-
317求调剂
已经有18人回复
-
293求调剂
已经有5人回复
-
280分求调剂 一志愿085802
已经有7人回复
-
0854电子信息求调剂
已经有3人回复
-
263求调剂
已经有4人回复
heshaoboli
木虫 (小有名气)
城市农村
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 3131.6
- 帖子: 118
- 在线: 142.6小时
- 虫号: 437909
- 注册: 2007-09-10
- 专业: 作物分子育种
2楼2007-11-30 11:15:06
