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heshaoboli

木虫 (小有名气)

城市农村

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[求助] cDNA文库构建求助

鱼类cDNA文库构建求助
各位高人好:
我把我们实验的大概情况说一下:去年师姐建库时用的试剂盒是用oligdT做引物反转录合成第一链,在给双链DNA加接头时加的是单一的EcoRI接头,与载体连接.没做出来,她又换了实验思路.还是没做出来，
所以现在由我们来做.存在的问题如下：
第一：没有试剂盒,以前的试剂盒用完了，没出结果，不太可能再让买了。建库要用的酶购自俩家公司,上海生工和TaKaRa（用的时候按酶说明书上的体系和操作，这样的话酶来自不同公司，影响大不大？）
第二：实验思路也要自己设计,我们的实验思路如下:
1、提取总RNA
2、用oligdT-衔接子（衔接子里酶切位点想加BamHI的，除了酶切位点以外的其他序列怎么设计？）反转录合成cDNA第一链。
3、合成第二链，末端补平
4、加单一的EcoRI接头（序列：5-AATTCCGTTGCTGTCG-3
3-GGCAACGACAGC-5-P）有没有必要做PCR验证接头是否加上？
5、去残余接头
6、用EcoRI接头引物（5-AATTCCGTTGCTGTCG-3，这个引物合适吗？）和oligdT-衔接子引物（此处引物怎么设计？如果完全跟oligdT-衔接子一样，这个引物会好长的啊）做PCR，预P出接头与衔接子之间的cDNA序列。（我们自己对这步设计不放心，因为看文献他们用的是Cassette Adaptor，我不知道我们在这里用EcoRI接头行不行）
7、将PCR产物直接与T载体连接。（PCR产物在与T载体连接前要不要纯化？）
8、转化，蓝白筛选。

第三：以前跟师姐做实验常遇到的问题有：
1、反转录产物太短，最近做的一次都在1Kb以下，以前做的集中在1Kb-2Kb之间。（我们以前温育的部分是在水浴中做的，最近那次是在PCR仪里做的，跟这个有关系吗？还是我们操作的问题？）
2、合成第二链后片段更短了。
3、蓝白筛选时很少长蓝斑，但白斑中一个阳性克隆都没验证出来。菌液PCR的结果是弥散的条带，有的甚至从点样孔的地方就有弥散。酶切质粒也没切出目的片段。（转化时我用空白质粒做对照，长出大量蓝斑，能否排除感受态细胞有问题？）（我师姐当时也设计了oligdT-衔接子，接头引物和oligdT-衔接子引物是她自己设计的，是不是引物设计的不合适造成了菌液PCR时出现弥散条带？）

我们现在面临的问题很多，极其希望得到各位高人的指点。先谢谢了！

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