| 查看: 863 | 回复: 7 | ||||
jonew木虫 (正式写手)
|
[求助]
PCR求助
|
|
我的目的片段是3000，为什么我这几天p出来的都是1000的而且只有这一条带！！ 酶也换过了，模板也换过了？梯度也做过了，我下一步应该怎么做？求各路？ |
回复此楼» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有230人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
lmcyjxs
金虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 17 (小学生)
- 金币: 1088.2
- 散金: 119
- 红花: 7
- 帖子: 954
- 在线: 124.3小时
- 虫号: 1255578
- 注册: 2011-04-05
- 性别: MM
- 专业: 中药资源
2楼2013-09-22 21:09:11
jonew
木虫 (正式写手)
- 应助: 21 (小学生)
- 金币: 4834.2
- 散金: 74
- 红花: 3
- 帖子: 648
- 在线: 163.6小时
- 虫号: 1983651
- 注册: 2012-09-07
- 性别: GG
- 专业: 拓扑学
3楼2013-09-23 09:48:29
4楼2013-09-23 11:14:21
RUI1990
银虫 (小有名气)
- 应助: 28 (小学生)
- 金币: 359.4
- 帖子: 61
- 在线: 114.7小时
- 虫号: 2408840
- 注册: 2013-04-09
- 性别: MM
- 专业: 天然药物化学
5楼2013-09-23 11:35:33
匿名
用户注销 (正式写手)
- 应助: 128 (高中生)
- 金币: 4550.4
- 散金: 50
- 红花: 22
- 帖子: 934
- 在线: 645.1小时
- 虫号: 0
- 注册: 2011-10-17
- 性别: GG
- 专业: 植物遗传学
6楼2013-09-24 11:58:43
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2119.9
- 散金: 10
- 红花: 209
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
jonew: 金币+5 2013-09-25 11:59:31
感谢参与，应助指数 +1
jonew: 金币+5 2013-09-25 11:59:31
|
楼主的情况是：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致。 我在2013年9月24日对此问题的总结如下，楼主可以参考： PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带，其原因与对策如下：一、引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体、或者GC比邻远离50%。对策：重新设计引物。二、Mg2+ 离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。 三、靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因： 1.整个基因组或大片段的交叉污染，导致非特异性带出现。这种非特异性带出现可用以下方法解决：（1）在加样枪的接头和吸杆之间加上脱脂消毒棉花，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。（2）除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。（3）所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。（4）重新提取模板DNA。2.空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有时候可能会互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致非特异性带出现的产生。虽然这样的可能性比较小。对策：实验前对实验室充分通风，试验时尽量加上PCR试剂暴露于空气中的时间，还可用巢式PCR方法来减轻或消除空气中的小片段核酸造成的污染，最基本的解决办法：重新提取模板DNA。 四、考虑使用热启动模式。可以购买商用的PCR热启动酶，也可以用石蜡隔离模式。 五、调整变性和退火温度时间。 六、更换所有缓冲溶液，使用全部新配的缓冲溶液。这点可能太基本了，很不被重视。 七、适当调高复性温度。没有重新设计引物，不要大范围地变动反应体系的复性温度，要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增，则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度提高1-3度；如果出现任何扩增带，则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度降低1-3度。 八、Taq酶的专一性扩增不够。往往一些来源的DNA聚合酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策：改用专一性更强的DNA聚合酶，或者使用两种不同的DNA聚合酶，减低酶量或调换另一来源的专一性高的酶。更换DNA聚合酶时，酶量不要太大，以免出现特异性扩增。 酶制剂中的甘油可能也是干扰因素。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油。 九、使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，非特异性扩增较多，这时，最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环，退火温度降低1-2度，直至到达正常的Tm附近的退火温度。 十、适当减低的dNTP的浓度，可以分梯度进行。 一般的调整顺序（不是绝对的）：若PCR反应后无任何产物，可先调整Mg2+ 浓度，Mg2+ 浓度不高于10.0mmol/L，不低于1.0mmol/L，调整时从低往高分梯度加，每次升高0.05mmol/L.最常使用Mg2+ 浓度为1.5mmol/L。同时全部重新配所有的缓冲溶液。 然后调整引物浓度，在调整引物与模板的结合温度，调整变性和退火温度时间。接着或者与引物调整同时，把酶换成其他类型的DNA聚合酶（高保真酶或者热启动酶）。再往后，检测和重新提取DNA模板（包括用质谱或者电泳检测DNA是否变短，清除酚和SDS，检测模板浓度，必要时要对DNA模板测序）。再往后和使用梯度降低dNTP。最后这些都做了仍未奏效，那么就要重新设计引物了。一般是最先调整Mg2+ 浓度，最后重新设计引物，其他顺序可变。Mg2+ 浓度与dNTP的浓度一般同方向偶联调节。 十一、适当减少退货时间和提高退火温度。 十二、在反应体系中加入：1.5mol/L的甜菜碱或者5%的DMSO可以提高PCR扩增效率。 过去，我也回答过PCR非特异性扩增的问题，但是这次回答我在2013年8月14日重新编辑核对的。 十三、使用巢式PCR。 |
7楼2013-09-24 12:23:22
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2119.9
- 散金: 10
- 红花: 209
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
【答案】应助回帖
|
楼主可以参考: John M.S.Bartlett and David Stirling, PCR Protocols(second Edition)-MMB-226 http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6385666 不要对我说无法下载，我没有设定任何限制，无法下载请换台电脑下载。我没有时间一一发送文件，见谅！ |
8楼2013-09-24 12:27:50
