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jonew

木虫 (正式写手)

[求助] PCR求助

我的目的片段是3000，为什么我这几天p出来的都是1000的而且只有这一条带！！
酶也换过了，模板也换过了？梯度也做过了，我下一步应该怎么做？求各路？
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借口很贱，，，
1楼 2013-09-22 20:44:48
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-22 21:28:50
引物好好检查下，看有无问题？
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思路决定出路。。。
2楼2013-09-22 21:09:11
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jonew

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-09-22 21:09:11
引物好好检查下，看有无问题？

谢谢
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借口很贱，，，
3楼2013-09-23 09:48:29
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iayala

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
使用NCBI的primer-BLAST好好检测一下你的引物设计！
另外，有时候，点赶上了，说不定模板真的缺失突变了。如果你很急，就好好分析下你的模板在遗传上有没有什么特殊性，我就遇到过target gene两侧带IS element的，呵呵，希望有帮助！
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4楼2013-09-23 11:14:21
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RUI1990

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引物出问题的可能性很大，再检查一下模板质粒！祝好运！
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做自己
5楼2013-09-23 11:35:33
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匿名

用户注销 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
本帖仅楼主可见
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6楼2013-09-24 11:58:43
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
jonew: 金币+5 2013-09-25 11:59:31
楼主的情况是：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致。

我在2013年9月24日对此问题的总结如下，楼主可以参考：

    PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带，其原因与对策如下：一、引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体、或者GC比邻远离50%。对策：重新设计引物。二、Mg2+ 离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。
三、靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：
1.整个基因组或大片段的交叉污染，导致非特异性带出现。这种非特异性带出现可用以下方法解决：（1）在加样枪的接头和吸杆之间加上脱脂消毒棉花，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。（2）除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。（3）所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。（4）重新提取模板DNA。2.空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有时候可能会互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致非特异性带出现的产生。虽然这样的可能性比较小。对策：实验前对实验室充分通风，试验时尽量加上PCR试剂暴露于空气中的时间，还可用巢式PCR方法来减轻或消除空气中的小片段核酸造成的污染，最基本的解决办法：重新提取模板DNA。
四、考虑使用热启动模式。可以购买商用的PCR热启动酶，也可以用石蜡隔离模式。
五、调整变性和退火温度时间。
六、更换所有缓冲溶液，使用全部新配的缓冲溶液。这点可能太基本了，很不被重视。
七、适当调高复性温度。没有重新设计引物，不要大范围地变动反应体系的复性温度，要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增，则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度提高1-3度；如果出现任何扩增带，则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度降低1-3度。
八、Taq酶的专一性扩增不够。往往一些来源的DNA聚合酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策：改用专一性更强的DNA聚合酶，或者使用两种不同的DNA聚合酶，减低酶量或调换另一来源的专一性高的酶。更换DNA聚合酶时，酶量不要太大，以免出现特异性扩增。    酶制剂中的甘油可能也是干扰因素。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油。
九、使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，非特异性扩增较多，这时，最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环，退火温度降低1-2度，直至到达正常的Tm附近的退火温度。
十、适当减低的dNTP的浓度，可以分梯度进行。
　　 一般的调整顺序（不是绝对的）：若PCR反应后无任何产物，可先调整Mg2+ 浓度，Mg2+ 浓度不高于10.0mmol/L，不低于1.0mmol/L，调整时从低往高分梯度加，每次升高0.05mmol/L.最常使用Mg2+ 浓度为1.5mmol/L。同时全部重新配所有的缓冲溶液。 然后调整引物浓度，在调整引物与模板的结合温度，调整变性和退火温度时间。接着或者与引物调整同时，把酶换成其他类型的DNA聚合酶（高保真酶或者热启动酶）。再往后，检测和重新提取DNA模板（包括用质谱或者电泳检测DNA是否变短，清除酚和SDS，检测模板浓度，必要时要对DNA模板测序）。再往后和使用梯度降低dNTP。最后这些都做了仍未奏效，那么就要重新设计引物了。一般是最先调整Mg2+ 浓度，最后重新设计引物，其他顺序可变。Mg2+ 浓度与dNTP的浓度一般同方向偶联调节。
十一、适当减少退货时间和提高退火温度。
十二、在反应体系中加入：1.5mol/L的甜菜碱或者5%的DMSO可以提高PCR扩增效率。
　　过去，我也回答过PCR非特异性扩增的问题，但是这次回答我在2013年8月14日重新编辑核对的。
十三、使用巢式PCR。
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7楼2013-09-24 12:23:22
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

楼主可以参考:
John M.S.Bartlett and David Stirling, PCR Protocols(second Edition)-MMB-226

http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6385666

不要对我说无法下载，我没有设定任何限制，无法下载请换台电脑下载。我没有时间一一发送文件，见谅！
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8楼2013-09-24 12:27:50
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