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wang6rrtoy银虫 (小有名气)
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[求助]
重金悬赏乙酸激酶、丁酸激酶的测定方法！跪求！！！
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| 各位大侠，小弟做发酵实验需测定乙酸激酶与丁酸激酶活性，但苦于找不到方法，求指教啊 |
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【答案】应助回帖
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乙酸激酶： 原理: 乙酸+ATP→乙酰磷酸+ADP（乙酸激酶） ADP+PEP→ATP+丙酮酸盐（丙酮酸激酶） 丙酮酸盐+β-NADH→乳酸盐+β-NAD（乳酸脱氢酶） 缩写的使用： ATP = Adenosine 5'-Triphosphate 腺苷三磷酸盐 ADP = Adenosine 5'-Diphosphate 腺苷二磷酸盐 PEP = Phospho(enol)Pyruvate 磷酸烯醇式丙酮酸盐 ß-NADH = ß-Nicotinamide Adenine Dinucleotide, Reduced Form ß-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 ß-NAD = ß-Nicotinamide Adenine Dinucleotide, Oxidized Form ß-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 条件： T=25℃；pH=7.6；A=340nm；光程=1cm 方法： 连续分光光度率测定 试剂： A，100mM三乙醇胺缓冲液pH 7.6，25°C，（准备50ml，用1M NaOH调成pH7.6） B，1M乙酸钠（用去离子水配制10ml）现配 C，91mM ATP（用去离子水配制3ml ATP二钠）现配 D，56mM PEP（配制1.5ml）现配 E，200mM MgCl2（配制5ml） F，6.4mM ß-NADH（取5mg加入适当去离子水溶解）现配 G，丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶 H，激肌酶溶液（2000-3000单位/ml，用冷的去离子水配制） I，乙酸激酶溶液（准备0.2-0.5单位/ml） 程序 移取试剂的量 A (Buffer) 17.80 B (NaOAc) 6.00 E (MgCl2) 1.00 F (ß-NADH) 0.50 混合，用0.1M HCl或者NaOH调至pH7.6，在25℃ Test Blank 混合物 2.53 2.53 G (PK/LDH) 0.05 0.05 H (MK) 0.02 0.02 倒置混合，在25℃下平衡，340nm下恒温分光光度计下检测 然后，添加： C (ATP) 0.20 0.20 D (PEP) 0.10 0.10 A (Buffer) ------ 0.10 I (Enzyme Solution) 0.10 ------ 一混合就倒置，并记录减少的吸光度，持续5min，使用最大线性率获得实验组和空白组的吸光度/时间 |
2楼2013-09-15 16:58:46
