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脂肪组织源基质细胞（ADSCs):细胞学工程的新选择
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目前，成体干细胞在组织再生和修复的研究中得到广泛应用，干细胞移植治疗急性 心肌梗死也成为近年来研究的热点。用于基础和临床研究的干细胞主要有胚胎干细 胞、骨骼肌卫星细胞、骨髓间充质干细胞等[1～3]，研究证明通过移植这些干细胞 可以减少梗死面积，改善心肌重塑，从而改善心脏功能[4]。胚胎干细胞只能进行异 体移植，来源困难，不仅存在免疫排斥的问题，还涉及到伦理学的问题。骨骼肌卫 星细胞和骨髓干细胞属于成体多能干细胞，可以进行自体移植，避免了上述问题， 但自体骨骼肌卫星细胞取材困难，目前研究及应用较多的是骨髓来源干细胞。但骨 髓来源干细胞也存在来源不足，取材困难,给患者带来较多痛苦所以较难为人们所接 受等缺点，因此需要寻找一种新的更易被患者接受的干细胞来源。脂肪组织同骨髓 一样，也从中胚层分化发育而来，并含有大量的易分离的支持细胞。2001年，ZUK[ 5]等从人的脂肪组织中成功分离出具有多向分化潜能的基质细胞（Adipose tissue -derived stromal cells, ADSCs），与其它成体干细胞相比，脂肪来源的基质细胞 取材更方便，更容易获取。这一发现为干细胞的来源提供了新的选择。 1 ADSC的命名 ADSC在以往研究中叫法不尽相同，有的称为PLA(processed lipoaspirate c ells)[5,6], 有的称之为脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells）[7]、脂 肪来源基质细胞（adipose-derived stromal cells, ADSC）[8] 、脂肪来源间充质 （干）细胞（adipose-derived mesenchymal/stem cells）[9,10]、脂肪来源成体 干细胞（Adipose-derived adult stem cells）[11]，还有的称为前脂肪细胞[12] （preadipocyte）, 其实质上也是这群细胞。这些不同的叫法说明对这群细胞尚缺 乏足够的了解和统一的认识，如对细胞的起源、表型、功能分化等等。而ADSC越来 越被人们所接受，因为这一叫法更能反映出该细胞的来源和特性[13]。 2 ADSC的获取 ADSC与MSC 一样，在外形上表现似成纤维细胞。而且，ADSC在皮下脂肪中的 含量是十分丰富的。与骨髓来源间充质干细胞相比，ADSC的提取更方便。骨髓间充 质干细胞只是骨髓单个核细胞群中的极小一部分。通常通过麻醉下抽取骨髓，采用 分层离析的方法获取骨髓背单个核细胞群，而单个核细胞群中绝大部分是造血干细 胞，而通过培养瓶贴壁筛选后，骨髓间充质干细胞只占贴壁细胞的0.001%[5]。而A DSC的提取相对更容易，量更多。Zuk[6]等应用真空抽吸技术从人皮下抽取脂肪，通 过I型胶原酶消化贴壁的方法共从300 ml吸出组织中获得（2～6）×108个成纤维细 胞样细胞，用流式细胞技术检测获得的细胞表面ASO2（间充质来源细胞特异性抗原 ）表明绝大多数细胞（85%±12.8%）为间充质来源的细胞，仅有少量的外皮细胞、 内皮细胞和平滑肌细胞。脂肪前体细胞（可进一步分裂并分化为脂肪）也仅占0.02 %。也就是说，从1 ml抽吸组织可以获得的细胞数量级在105。我们的研究（尚未发 表）比较了犬的皮下脂肪和骨髓提取干细胞的能力也发现，每克脂肪可获取的贴壁 的原代基质细胞数在106个左右；而骨髓通过梯度分层离心的方法获得的单个核细胞 群约每毫升（0.5～1）×107。如果考虑到骨髓间充质干细胞只占其中的0.001%～0 .01%，则每毫升骨髓只可获得102～103数量级的MSC。而且在体外进行培养扩增，A DSC对培养基没有特殊要求，扩增迅速，经多代传培养，倍增时间保持稳定（约60 h）。AILHAUD GERARD申请的美国专利US2004229351[14]称，从成人脂肪组织中分 离得到的多能干细胞，具有端粒酶活性、HLA Ⅰ阴性表型（流式细胞仪检测）、正 常染色体组、具有至少130代分裂增殖的自我更新能力。而且脂肪组织含量丰富,远 大于骨髓组织,因而有可能从脂肪组织中分离出充足的基质干细胞,不经过培养而直 接用于细胞移植治疗。 3 ADSC的鉴定 ADSC与骨髓间充质干细胞十分相似，二者都代表了通过培养瓶内粘附法从脂肪 库中分离的基质细胞部分，只不过前者是来源于皮下脂肪，后者来源于骨髓脂肪。 二者的细胞表面抗原标志也大部分相同，仅有很小差异。Gronthos S[15]等研究发 现，人的ADSC与骨髓间充质干细胞表面标志CD9，CD10，CD13，CD29,CD34，CD44， CD49(d)，CD49(e)，CD54，CD55，CD59，CD105，CD146和CD166相同；De Ugarte D A[16]等人研究了5例脂肪抽吸术患者来源的骨髓间充质干细胞和脂肪干细胞表面显 型。将PLA脂肪细胞和BM-MSC分离、传代，然后通过流式细胞仪鉴定了细胞表面标志 。PLA和BM-MSC细胞均表达CD13, CD29，CD44，CD90，CD105，SH-3和STRO-1，而细 胞粘附分子CD49d(粘合素-α4),CD54(ICAM-1),CD34和CD106 (VCAM-1)的表达不同。 这些不同的细胞粘附分子与造血干细胞的归巢、动员和增殖有关。Nakagami等[17] 研究C57B1/6小鼠也发现ADSC表达Sca1(ly-6A/E)（干细胞抗原ly-6A/E，小鼠造血干 细胞标志分子）和CD44抗原，但不表达 c-kit(小鼠多能干细胞表面阳性分子标志之 一)，Lin(小鼠多能干细胞表面阴性分子标志)，CD11 b，CD31，CD34，CD45。而且 ，这些细胞表面标志随多次传代培养表达稳定。我们对大鼠的ADSC的研究发现，细 胞连续传代11代，细胞表面标记无改变。 从以上研究发现，不同的研究对于表面标志CD34是否阳性结果不同。有研究 [18]发现新分离未接触培养瓶的ADSC与经培养瓶培养后的ADSC细胞表面标志发生明 显变化：新鲜分离的ADSC中90%以上CD34阳性表达，但经3至5天体外培养后表达明显 减少。这可能可以解释以往不同的研究结果。 4 ADSC的多系分化能力 单从细胞表面标志是无法鉴定ADSC的。除了与MSC大部分标志相同，而且与成 纤维细胞更难区分。因为不仅在形态相似，而且表面细胞标志更是接近[19]。因此 单纯以细胞不表标志来鉴定ADSC明显不足。由于间充质干细胞与成体细胞最大的区 别在于它具有向不同的间质组织如骨、软骨、肌肉、肌腱，脂肪、神经、血及血管 组织多向分化的能力，因此进行多系定向诱导证明它的多向分化能力可能是较好的 鉴定干细胞的方法。不同研究已经证明皮下脂肪组织来源的基质细胞同MSC一样具有 多系分化的能力。体外诱导研究证明，在专门的诱导因子存在的条件下，ADSC可以 分化为脂肪细胞、骨和软骨细胞、（心）肌细胞[6，7]。但与MSC相比，ADSC分化为 脂肪细胞的效率更高，而MSC分化为骨和软骨细胞的能力更高[20]。 另外，还可以 诱导分化为肝细胞[21]、神经细胞等[22]。这些研究为ADSC的广泛应用拓宽了基础 。 5 ADSC可以作用有效的基因载体用于基因治疗 研究还发现，ADSC可以作为有效的治疗基因载体，与MSC不相上下。一项研究 [23]比较了ADSC与MSC对5型腺病素、致瘤逆转录病毒及慢病毒的转染效果发现，在 MOI值为14时慢病毒就可以获得较高的转染效率(>90%)，是致瘤逆转录病毒的4至5倍 ，而且不影响细胞的生长、传代和分化。在其它一些研究[24~26]中运用腺病毒转染 目的基因均获得良好的效果。 6 ADSC的旁分泌功能 ADSC 可以分泌具有生物活性的VEGF、HGF、TGF-β等多种促进血管新生的因 子[27，28]，在缺氧条件下，VEGF分泌明显增加高达5倍。用缺氧条件下的ADSC培养 上清可以加速内皮细胞的生长，减少内皮细胞的凋亡[28]。Hironori [13]等用定量 实时PCR分析的方法发现ADSC除了表达较高水平的VEGF、HGF、TGF-Β外，还可以高 表达PGF(placental growth factor),中度表达FGF(fibroblast growth factor)-2 和 Ang(angiopoietin)-1，低水平表达Ang-2。 7 ADSC的免疫调节作用 同MSC一样，ADSC也具有免疫压制效应，可以调节移植物抗宿主病（GVHD）。 Puissant B[29] 等发现，在体外ADSC不仅不会激活同种异体的非相容的淋巴细胞， 而且可以压抑丝裂原刺激后的混合淋巴细胞反应（MLR）和淋巴细胞增殖反应，并且 这种抑制作用呈脂肪干细胞细胞数量依赖性；这种作用必需是在与淋巴细胞有效接 触的条件下，若用通透性膜把ADSC与淋巴细胞隔离开，则抑制作用会减弱。研究认 为这一作用与ADSC的分泌作用无关。Yanez R[30]等通过对小鼠GVHD调节的研究发现 ，小鼠和人的ADSC的免疫调节特点与人的骨髓MSC相似；而且人的ADSC可以抑制人丝 裂原和异体T细胞刺激后的前淋巴细胞的增生和细胞因子的分泌；给移植半相合造血 干细胞的小鼠输注ADSC可控制致死性GVHD的发生，而有研究[31]发现骨髓MSC却不能 抑制在体GVHD。ADSC的这一作用特点似乎可用异体移植物的免疫排斥治疗。 8 棕色脂肪与BATDCs 脂肪组织又分为白色脂肪和棕色脂肪，二者在生长发育上存在基因的差别。白 色脂肪主要与能量的贮存有关，而棕色脂肪与能量的消耗有关[32]。Yamada Y等[3 3]从棕色脂肪中分离出来的基质细胞被命名为BATDCs（brown adipose tissue der ived cells），其中的CD29阳性细胞群比MSC和脐血来源干细胞更容易分化为心肌。 在给急性心梗大鼠的梗死区心肌移植CD29阳性的BATDC后，大鼠的梗塞面积和左室心 功能两项指标的改善显著优于白色脂肪ADSC细胞移植组和空白对照组。Yamada Y等 进一步研究[34]发现，CD133阳性的BATDCs本身不仅有较高的心肌细胞转化率，而且 ，这一组细胞还可以通过与骨髓来源MSC共培养时形成二价阳离子共价联接来诱导骨 髓来源的MSC转化为心肌细胞。 9 ADSC的应用展望 ADSC可以分化为多系组织细胞，这对于组织细胞替代和器官修复治疗是十分 有意义的。研究发现ADSC在体外可以分化为自发跳动的心肌细胞[35]，在体可以转 化为具有心肌细胞结构并有电压依赖性的钙通道和钾通道[36]，因此目前研究用AD SC来治疗急性心梗和严重心衰。本实验室在前面研究[37]中给结扎前降支动脉的犬 心梗模型坏死周边区心内膜下注射ADSC，发现可明显改善心梗后心功能。而成骨作 用可能用于骨髂的再生和修复[36]；ADSC的旁分泌作用可被用来治疗缺血性疾病： 有研究[13，28]用ADSC治疗双下肢缺血动物模型取得良好效果，可显著增加缺血下 肢的血流量及毛细血管密度。ADSC的成脂作用可用于整形和重建手术[39]。ADSC的 免疫压制效应使得ADSC可以实行异体移植，提高了ADSC临床应用的可操作性，还可 以在器官移植抗排异反应中发挥作用。另外，ADSC可以作为适合的基因载体为基因 治疗提供了新的途径[40]。 作者单位：北京 100853，解放军总医院心内科 作者简介：秦宇红，男，主治医师，博士研究生，研究方向：心肌梗死及心力衰竭 的干细胞治疗。 世界急危重病医学杂志2007；4（3）：1889-1892 |
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