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lizhijiang木虫 (著名写手)
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高质量DNA获取方法之月桂酸钠法（转） 已有6人参与
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科学网http://blog.sciencenet.cn/blog-657244-721856.html 高质量DNA获取方法之月桂酸钠法 徐大彬 从组织中获取DNA难吗？不难，真不难。高一就有开设的从鸡血中获取DNA的生物实验课，很简单的几步就可以得到DNA。但要想获取高质量的DNA，尤其是从一些富含多糖、多酚、淀粉、纤维和蛋白的组织，后面用于酶切、高通量测序大片段文库的构建,还是有一定的难度的。 最近协助北京农业生物技术研究中心一个老师提取桃叶片DNA还是遇到了一些困难，因为老师要做桃的个体重测序，因此对DNA的要求还是非常高的。之前跟其他很多老师交流植物DNA的提取，大多数目前仍然使用CTAB法，有些老师购买试剂盒进行提取，其实很多植物DNA提取试剂盒成分也是CTAB。CTAB法是提取植物DNA非常经典方法，但在提取的过程中由于要在65℃水浴中放置1个小时，因此耗时较长。我们在使用该法提取桃DNA时，获得DNA中含有大量的蛋白和多糖，虽然通过多次的苯酚氯仿抽提可以大部分去除，但DNA得率较低。在这里给大家分享一种快速获取植物高质量DNA的方法，供大家在提取植物DNA时作为参考，用该法提取的植物DNA完全满足后续酶切、BAC文库构建、高通量测序大片段文库构建，将该法称之为月桂酸钠法。 月桂酸钠抽提缓冲液： Tris-Hcl（pH8.0）100mmol/L；NaCl 100mmol/L；EDTA（pH8.0）20mmol/L；月桂酸钠 1%； 配法：准确称取NaCl 5.844g，月桂酸钠 10g置于1000mL烧杯中，加入100ml Tris-Hcl（1M）以及40mLEDTA（0.5M）、800mlddH2O，用盐酸调节pH至8.0，定容至10000mL，灭菌后室温保存。 月桂酸钠英文名称：sodium lauroyl sarcosine 分子式：C15H28NaO3N，分子量：293.39。 以该法大量获取玉米叶片DNA为例的实验流程： （1）选取适量的玉米幼苗新鲜叶片，以纱布捆扎，做好标记，置于液氮中保存； （2）研钵以液氮预冷，将玉米叶片置于研钵中，倒入液氮，迅速研磨至粉末级，期间时时加入液氮，防止研磨过程中DNA被降解； （3）将研磨好的粉末移入灭菌后的50mL抽提试管中，用移液管加入10mL月桂酸钠抽提缓冲液，反复缓慢的摇匀； （4）用移液管向50mL抽提试管中加入等体积（10mL）酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），反复缓慢的摇匀； （5）12000 rpm，4°C离心20min后取出，小心吸取上清液16mL于新灭菌的50ml抽提试管中； （6）向上述抽提试管中加入12mL异丙醇，上下缓慢颠倒数次，有白色絮状沉淀析出，颠倒时注意往一个方向，防止沉淀散开，不利于后续实验； （7）将白色絮状沉淀用枪头从抽提试管中轻轻挑出，至于2mL EP管中； （8）向上述2mL EP管中加入1.8mL70%乙醇，反复轻轻震荡洗涤，4°C，12000 rpm，高速离心15min，弃上清，重复此步骤两次； （9）将得到的白色沉淀再次4°C，12000 rpm短暂离心数秒，以移液器吸干残留乙醇； （10）白色沉淀置于37°C干燥箱中，使残存的70%乙醇全部挥发干净，这个过程中要经常拿出观察，防止过度烘干，不利于后面溶解； （11）待白色沉淀变透明后，向2mLEP管中加入0.9mLTE缓冲液（pH8.0），放置于65℃恒温箱中，期间轻微弹匀，使DNA充分溶解； （12）DNA完全溶解后，加入5μL RNase(0.1mg/mL)，置于37°C干燥箱中30min，消化RNA，取出3μL，以1%琼脂糖胶检测是否有RNA残留； （13）待RNA消化完成后，向EP管中加入等体积（0.9mL）氯仿，轻轻摇匀； （14）4°C，12000 rpm高速离心15min； （15）吸取0.7mL上清置于1.5ml新EP管中，加入1/10体积(约0.07mL)NaAc(3M/L)溶液，轻轻摇匀； （16）向上述EP管中加入等体积（0.7mL）异丙醇，轻轻摇匀后，于-20°C静置20min； （17）4°C，12000 rpm高速离心15min，弃上清； （18）将得到的白色沉淀以70%乙醇洗涤两次，去除残留的乙醇； （19）白色沉淀置于37°C干燥箱中，使残存的70%乙醇全部挥发干净，该过程中要经常拿出观察，防止烘干过度，不利于后面溶解； （20）待白色沉淀变透明，管中无残留的乙醇味后，加入200μL TE（pH8.0），于37°C干燥箱中溶解； （21）待DNA完全溶解后，取出1μL，以分光光度计测定OD值，分装后于保存（-20°C）。 以该法获取的玉米叶片DNA电泳图如下： DNA提取过程中常见问题及建议解决方案： 常见问题 可能原因 建议解决方案 洗脱产物的DNA量很少或没有 所提样品材料老化或反复冻融导致基因组DNA含量下降 应选择新鲜的样品材料，如新鲜血液、新鲜菌液、刚离体的动物组织或幼嫩的植物组织等，不能即时处理的样品应立即放入液氮或-70℃低温保存，以免DNA降解。 样品破壁或裂解不完全导致基因组DNA未充分释放 动、植物材料应在液氮中充分研磨匀浆，G+细菌、酵母等破壁较困难的样品应用溶菌酶、酵母破壁酶或机械方式协助破壁，不同样品的细胞破壁方式可参照前面的详细介绍。 样品量过多导致细胞裂解不充分 加样量过多使裂解液和样品混合不均匀，细胞裂解不充分。不同来源样品的加样量请参照详细操作步骤。 DNA吸附不充分 如在上吸附柱前末加无水乙醇，或用低浓度乙醇代替无水乙醇，则导致DNA不能充分沉淀，与硅胶膜吸附不彻底，因此应在样品裂解后加适量无水乙醇，再上吸附柱使DNA与硅胶膜充分吸附。 DNA洗脱不适当 洗脱液pH值过低会降低洗脱效率，应确保洗脱液pH值在7.0-8.5之间；洗脱体积若小于30μ，则不易完全浸透硅胶膜，使DNA不能全部洗脱下来，因此洗脱液体积应大于30 μl，同时如洗脱液体积过大，超过200μl，则所得的DNA浓度会降低，但DNA总量不会减少；洗脱时可将洗脱缓冲液在65-70℃水浴预热，加入洗脱液后在室温静置2-5分钟，可提高洗脱效率，提高基因组DNA的产量。 提取的基因组DNA有降解 选取的材料不新鲜或反复冻融，采集材料后未及时处理或末低温保存 陈旧血液、老化菌液等不新鲜的材料中，细胞凋亡导致DNA降解，或低温保存的样品反复冻融导致细胞破碎，内源核酸酶降解DNA，因此应选择新鲜的材料样品，不能及时处理则低温保存，运输过程中亦应使用干冰。 未能有效抑制内源核酸酶作用 某些DNase含量较丰富的动、植物组织样品应在液氮中研磨或匀浆，研磨过程中应随时补充液氮，并在样品末完全解冻前即加入含有抑制核酸酶作用的鳌合剂的裂解液。 操作过于剧烈导致DNA被机打断 预处理的样品加入细胞裂解液后，所有操作应尽量柔和，避免振荡、搅拌等剧烈机械力对DNA片段的损伤。 提取的基因组DNA中有RNA污染 实验过程中没有有效使用RNase A 应严格按照实验操作要求使用，即加入裂解液的同时加入20μl RNase A溶液，室温放置10分钟。 RNAase A可能失活 RNase A须在-20℃下保存，低温保存时RNase A比较稳定，不易失活，但如果反复冻融会导致RNase A降解失活，所以应妥善保存。 提取的基因组DNA不能顺利地进行后续试验 样品量过多导致细胞裂解不充分 样品量过多会使裂解液不能快速有效地与样品充分混合，从而导致样品裂解不彻底，残留大量蛋自、多糖、脂类等杂质，为后续的上吸附柱分离纯化造成影响。应加入适当量的样品材料，具体数量请参照详细操作步骤。 DNA在洗脱前有大量乙醇残留 有机溶剂乙醇可严重抑制内切酶、DNA聚合酶的活性，而在DNA过柱洗涤过程中需使用含有乙醇的漂洗液，因此在洗脱DNA前，—定要充分去除残留的乙醇，可重复离心，或将吸附柱置于室温或50℃温箱中烘干5-10分钟，再加洗脱液。 来源：http://www.chem17.com/st151778/Article_105896.html 致谢！ |
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