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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » [求助]关于构建cDNA文库
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柠檬酸诺

[交流] [求助]关于构建cDNA文库

cDNA第一链在-20度能放多久?若放置2周后再合成第二链会不会对结果有影响呢?
我在对构建的cDNA文库进行蓝白筛选时,挑了不少白斑,但菌液PCR没鉴定出一个阳性克隆来,PCR的结果图是一片弥散的条带,类似cDNA条带.提质粒酶切也没切出目的条带.这是什么原因?没有将目的片段跟载体连接成功吗?
感受态制备没问题,因为我用空白质粒做了对照,平板上长满了蓝斑;转化也应该没问题吧,不然很难在有抗生素的平板上长出菌落来吧.排除了这些因素,就只有连接值得怀疑了,可我是把双链cDNA进行PCR后与T载体连接,连接效率应该很高,同实验室的人也用一样的栽体,连接效率不错,我的问题到底出在哪呢?
希望各位虫虫帮忙分析,不胜感激啊!

[ Last edited by telomerase on 2007-11-12 at 16:52 ]
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1楼 2007-11-12 15:07:55
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reasonspare

木虫 (著名写手)
★
telomerase(金币+1,VIP+0):老大继续解释下！！楼主在问您呢！！！
cDNA 放置一段时间没有关系，
应该还是的感受态的问题，既然 有兰斑 也有白斑9当然如果是卫星菌落 就不对了
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2楼2007-11-12 15:46:44
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柠檬酸诺

空白对照长出很多蓝斑啊,为什么还可能是感受态的问题呢?
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3楼2007-11-12 16:06:52
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reasonspare

木虫 (著名写手)
★
johnsooh(金币+1,VIP+0):thx, 多谢分析
我做过一次实验，结果是这样，整个平板都是白斑，后来有人告诉，可能是感受问题，就是没有阳性克隆，
你现在也是这种现象尽管有兰斑（我的也一样），转化后同样出现白斑，但是就是没有PCR结果，我刚开始也很奇怪，但是后来，改了一下感受态，就好了。
也就是说 无论感受态 效率多高，也不肯能是100%，

还有，你如果放心你的感受态，
你可以看看你的链接体系，
载体 和DNA的比例，不要超过推荐的， 不是越多越好。

[ Last edited by reasonspare on 2007-11-12 at 17:02 ]
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4楼2007-11-12 17:00:21
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柠檬酸诺

好的,那我再试下,谢谢!
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5楼2007-11-12 17:14:52
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柠檬酸诺

你感受态是怎么改的啊?
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6楼2007-11-12 17:16:01
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reasonspare

木虫 (著名写手)
直接换公司的，哈哈哈，
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7楼2007-11-12 17:31:01
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)
★
telomerase(金币+1,VIP+0):thanks！
cDNA第一链在-20度放置应该问题不大，但我觉得最好还是合成双链后再放置，第二链合成又不是很麻烦；
菌落PCR直接以菌落作模板经常扩增不出来。将菌液在沸水浴中煮5min后作模板试一试；
别的我也不知道了
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漫洒英雄泪，相离处士家。谢慈悲剃度在莲台下。没缘法转眼分离乍。赤条条来去无牵挂。那里讨烟蓑雨笠卷单行？一任俺芒鞋破钵随缘化！
8楼2007-11-13 07:17:29
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