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[求助]关于构建cDNA文库
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cDNA第一链在-20度能放多久?若放置2周后再合成第二链会不会对结果有影响呢? 我在对构建的cDNA文库进行蓝白筛选时,挑了不少白斑,但菌液PCR没鉴定出一个阳性克隆来,PCR的结果图是一片弥散的条带,类似cDNA条带.提质粒酶切也没切出目的条带.这是什么原因?没有将目的片段跟载体连接成功吗? 感受态制备没问题,因为我用空白质粒做了对照,平板上长满了蓝斑;转化也应该没问题吧,不然很难在有抗生素的平板上长出菌落来吧.排除了这些因素,就只有连接值得怀疑了,可我是把双链cDNA进行PCR后与T载体连接,连接效率应该很高,同实验室的人也用一样的栽体,连接效率不错,我的问题到底出在哪呢? 希望各位虫虫帮忙分析,不胜感激啊! [ Last edited by telomerase on 2007-11-12 at 16:52 ] |
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6楼2007-11-12 17:16:01
reasonspare
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2楼2007-11-12 15:46:44
3楼2007-11-12 16:06:52
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johnsooh(金币+1,VIP+0):thx, 多谢分析
johnsooh(金币+1,VIP+0):thx, 多谢分析
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我做过一次实验，结果是这样，整个平板都是白斑，后来有人告诉，可能是感受问题，就是没有阳性克隆， 你现在也是这种现象尽管有兰斑（我的也一样），转化后同样出现白斑，但是就是没有PCR结果，我刚开始也很奇怪，但是后来，改了一下感受态，就好了。 也就是说 无论感受态 效率多高，也不肯能是100%， 还有，你如果放心你的感受态， 你可以看看你的链接体系， 载体 和DNA的比例，不要超过推荐的， 不是越多越好。 [ Last edited by reasonspare on 2007-11-12 at 17:02 ] |
4楼2007-11-12 17:00:21
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