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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 放线菌DNA 提取不出来，第一次做这方面的，没经验，还望指正
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美丽的家园

金虫 (正式写手)
送红花一朵
???????:
10?: Originally posted by lmhzy1987 at 2013-08-19 12:59:00
????????????????????????????????????????????Ч?????????????????

加溶???酶过夜处???我试了，没什么???化，超声波20min.还是一样，?????也太厚了，裂解至??明，真看??出。没有细胞破碎仪，能???研磨？

[ ????С??????? ]
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11楼2013-08-19 15:39:28
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czllxm

新虫 (初入文坛)
模板只是用来做PCR吗？
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12楼2013-08-19 17:43:06
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美丽的家园

金虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by lmhzy1987 at 2013-08-19 12:59:00
溶菌酶处理时间太短了，过夜没问题，可以用细胞破碎仪打一下效果更好，菌体稍微多点

溶菌酶过夜并且放在摇床60 r/min,第二天变化不大，我就用超声波处理20 min,菌体仍旧无法裂解到透明，后面就SDS 60℃放置90 min，随后室温30 min;菌壁还是无法裂解，实在是太厚。没有细胞破碎仪，能否把菌体过滤、烘干、低温研磨，像提真菌那样提取呢？
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13楼2013-08-19 18:52:33
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美丽的家园

金虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by czllxm at 2013-08-19 17:43:06
模板只是用来做PCR吗？

鉴定放线菌，跑PCR模版不纯，后期回收DNA影响是不是很大呢？
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14楼2013-08-20 00:14:49
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lmhzy1987

金虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 美丽的家园 at 2013-08-19 18:52:33
溶菌酶过夜并且放在摇床60 r/min,第二天变化不大，我就用超声波处理20 min,菌体仍旧无法裂解到透明，后面就SDS 60℃放置90 min，随后室温30 min;菌壁还是无法裂解，实在是太厚。没有细胞破碎仪，能否把菌体过滤、烘 ...

菌体不用裂解到透明，SDS终浓度2%，不用采取过滤、烘干，你的除非是稀有放线菌，不然不会那么难提，菌体最好新鲜些
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头疼的文库
15楼2013-08-20 11:49:47
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美丽的家园

金虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by lmhzy1987 at 2013-08-20 11:49:47
菌体不用裂解到透明，SDS终浓度2%，不用采取过滤、烘干，你的除非是稀有放线菌，不然不会那么难提，菌体最好新鲜些...

采样点保护比较好，稀有放线菌也许吧，菌体是新鲜的，针对稀有放线菌有没有什么比较好的方法？加乙醇留沉淀，离心、是可以看到微量白色沉淀，但不溶于TE，琼脂糖电泳也检测不出，很有能是杂质，不知道有没有必要跑一下PCR再检测
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16楼2013-08-20 22:40:55
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yanyan120

银虫 (小有名气)
提取dna，听着都好复杂哦。。。祝楼主好运。。
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共勉共勉。
17楼2013-08-21 08:12:35
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美丽的家园

金虫 (正式写手)
送红花一朵
多谢
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18楼2013-08-22 17:37:12
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琴音

新虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 美丽的家园 at 2013-08-22 17:37:12
多谢

我也做过放线菌的鉴定，微波发还行的。简单，快速，成本低。
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19楼2013-08-24 11:01:04
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181587941

金虫 (正式写手)
我怀疑楼主做的极端放线菌。我以前做过，发现很多放线菌，尤其是极端放线菌是抗溶菌酶的，因此用溶菌酶是不行的。建议用液氮研磨破碎，保证能提出来
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20楼2013-08-24 20:14:22
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