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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 双酶切问题
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天马0825

银虫 (小有名气)

[求助] 双酶切问题

各位大侠，我最近在做克隆表达，筛选转化子，提取质粒，以质粒为模版进行PCR后可以出来目的基因，但是双酶切时却没有目的条带，不知怎么回事？还望高手指点。。。
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自信加努力成就人生
1楼 2013-07-19 22:31:01
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天马0825

银虫 (小有名气)
对了，我用到的酶是Takara的Ndel 和 Xbal 。
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自信加努力成就人生
2楼2013-07-19 22:33:11
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HTGe

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+2, 鼓励应助！ 2013-07-21 12:32:47
这是分子克隆中很常见的问题；建议你检查几方面问题：首先，检查所用的两个酶是否失活；另外，你没有讲清楚，你双酶切后是切成了单链还是跟原来质粒没有任何区别。此外也有酶切位点被降解掉一个或两个碱基而无法被切割的情况存在。建议你把问题描述的更清楚些。
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3楼2013-07-20 00:01:00
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499649610

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+2, 鼓励新虫回帖交流！ 2013-07-21 12:33:07
双酶切后你的片段大小各是多大，如果一个6、7千，一个一百多，浓度不是很高的话 小片段看不到是 正常的！还有你BUFFER的用量是否正确？
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4楼2013-07-20 14:32:37
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---vivian---

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+2, 鼓励新虫回帖交流！ 2013-07-21 12:33:38
也有可能是酶切位点有问题，之前我们实验室有人设计引物时把cg弄错了，结果怎么切都不行，当时他用的是EcoRI。
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QQ1481397330
5楼2013-07-20 19:02:25
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天马0825

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by HTGe at 2013-07-20 00:01:00
这是分子克隆中很常见的问题；建议你检查几方面问题：首先，检查所用的两个酶是否失活；另外，你没有讲清楚，你双酶切后是切成了单链还是跟原来质粒没有任何区别。此外也有酶切位点被降解掉一个或两个碱基而无法被切 ...

酶是刚买的，应该没问题。双酶切以后，比原来质粒小了，条带离点样口远了些。但是只有一条，目的条带是一千多的，因该可以看到的，载体4千多。。。
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自信加努力成就人生
6楼2013-07-22 15:32:33
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天马0825

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 499649610 at 2013-07-20 14:32:37
双酶切后你的片段大小各是多大，如果一个6、7千，一个一百多，浓度不是很高的话 小片段看不到是 正常的！还有你BUFFER的用量是否正确？

双酶切后，一个4千多，目的一千多。BUffer用的10×T（Katara），10μl 体系加了1μl。
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自信加努力成就人生
7楼2013-07-22 15:36:02
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