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574759350

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by gyesang at 2013-07-07 13:54:32
这个你可以借鉴商业化载体pETduet-1的设计,图谱见附件...

好的,谢谢!
11楼2013-07-07 19:30:51
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

这就是表达两个基因组成的融合蛋白的问题,不用去考虑什么原核与真核细胞,只要构建在你要表达的细胞中能够表达的载体即可,把5’端的那个基因的终止密码子去掉,换成一段十几个亲水氨基酸的密码子构成的核苷酸序列,然后接上第二个蛋白质的密码子,要保证ORF框的正确读码,这样第二个蛋白质都顺利表达了出来。在两个蛋白质要有酶切位点,表达出了融合蛋白质后用特定的水解酶切断,形成两个独立的蛋白质,两者之间为一段十几个亲水氨基酸一般干扰两个蛋白质的正确折叠。

不过,我想不出为何要把第二个蛋白质的基因倒置,没有必要呀,反正最后要用蛋白酶切开成为两个独立的蛋白质。
12楼2013-07-08 22:45:52
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
1. 首先,技术上没有问题,这个做了很多成功的例子了。
2. 原核表达,直接用楼上说的pETDuet比较方便,不过你要注意片断的插入顺序。
3. >3个片断的插入,建议你用shuttle vector配合酵母的recombination的能力来做,这样能够一次性直接构造出你想要得。具体文章你可以在nucleic acids research上找吧
13楼2013-07-09 15:25:03
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