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铁虫 (小有名气)

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10楼: Originally posted by gyesang at 2013-07-07 13:54:32
这个你可以借鉴商业化载体pETduet-1的设计，图谱见附件...

好的，谢谢！

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11楼2013-07-07 19:30:51

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凌波丽

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【答案】应助回帖

这就是表达两个基因组成的融合蛋白的问题，不用去考虑什么原核与真核细胞，只要构建在你要表达的细胞中能够表达的载体即可，把5’端的那个基因的终止密码子去掉，换成一段十几个亲水氨基酸的密码子构成的核苷酸序列，然后接上第二个蛋白质的密码子，要保证ORF框的正确读码，这样第二个蛋白质都顺利表达了出来。在两个蛋白质要有酶切位点，表达出了融合蛋白质后用特定的水解酶切断，形成两个独立的蛋白质，两者之间为一段十几个亲水氨基酸一般干扰两个蛋白质的正确折叠。

不过，我想不出为何要把第二个蛋白质的基因倒置，没有必要呀，反正最后要用蛋白酶切开成为两个独立的蛋白质。

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12楼2013-07-08 22:45:52

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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

1. 首先，技术上没有问题，这个做了很多成功的例子了。
2. 原核表达，直接用楼上说的pETDuet比较方便，不过你要注意片断的插入顺序。
3. >3个片断的插入，建议你用shuttle vector配合酵母的recombination的能力来做，这样能够一次性直接构造出你想要得。具体文章你可以在nucleic acids research上找吧

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13楼2013-07-09 15:25:03

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