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请教用于微卫星电泳分析的变性聚丙烯酰胺凝胶的配方及制备方法
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有谁做过水稻的ＳＳＲ标记？我现在打算用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，但是是第一次做，所以不太清楚配方和浓度，请高手赐教，谢谢 [ Last edited by johnsooh on 2007-10-23 at 20:36 ] |
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reasonspare
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SSR和AFLP所用PAGE一样，所以 详见： http://reason.5d6d.com/thread-33-1-1.html AFLP 标准方法 AFLP的试剂配制 1、40％ PA Acrylamide (丙稀酰胺) W/V 380g N,N’-Methylene Bisacrylamide(甲叉双丙稀酰胺) W/V 20 g H2O（去离子水） V 600ml/1000ml 注：先加水至600ml，加热至37℃以促进溶解，用去离子水定容至1000ml，用硝酸纤维素膜过滤（孔径0.45μm），室温储存与棕色瓶中。 丙稀酰胺是一种强的神经毒剂并可以通过皮肤吸收（其效应是累加的）。当称量粉末状丙稀酰胺和亚甲丙稀酰胺时，要戴合适的手套和口罩，在通风橱中操作，人们认为时多聚丙稀酰胺是无毒的，但是宜应小心操作，因为可能含有少量的未聚合的丙稀酰胺。 2、10％ m/V 过硫酸胺水溶液（Ammonium Persulphate） 超纯过硫酸胺 W 2g 超纯水 V 18ml 注：存贮在4℃，过硫酸胺在溶液中很容易慢慢衰变，故只能存放2-3周，过硫酸胺用作丙稀酰胺和亚甲基丙稀酰胺共聚作用的催化剂，聚合反应是通过氧化－还原反应产生的自由基驱动的，在氧化－还原反应中二胺氧化酶（如TEMED）是附加催化剂。溶解后，分装500ul，-20℃保存。 3、10× TBE buffer Tris－base 89mmol/L Tris base W 108g 硼酸 89mmol/L 硼酸 W 55g EDTA 2mmol/L EDTA V 40ml 0.5mol/L EDTA(pH 8.0) 去离子水 V 600ml/1000ml pH 8.3 注：先加水至600ml，加热以促进溶解，用去离子水定容1000ml。如果出现沉淀就应该放弃。使用时稀释10倍，应为PAGE电泳缓冲液的电流通常较大，需要使用1×TBE才能保证足够的缓冲容量。新配制的10×TBE要认真检查pH至8.3。使用同样的电泳缓冲液配制胶和工作缓冲液，因为两者之间微小的差异也会导致DNA迁移严重的扭曲。 硼酸可因为吸入和咽下和皮肤吸收而危害健康。操作时要戴手套和口罩。 4、Loading Buffer（甲酰胺加样缓冲液） 98％ Formamide（去离子化甲酰胺） 49ml（100％） 10mM EDTA （pH 8.0） 1 ml (0.5 M ,pH 8.0) 0.25% Bromphenol blue （溴酚兰） 0.125g 0.25% Xylene Cyanol(二甲苯氰) 0.125g 注：甲酰胺一定是去离子化的，保证足够的纯，如果出现黄色，则需要进行去离子处理，去离子甲酰胺应分装成小份，冲氮贮存与-70℃。 溴酚兰可因为吸入和咽下和皮肤吸收而危害健康。操作时要戴手套和口罩。 甲酰胺是一种致畸剂，其挥发的气雾对眼睛，皮肤，黏膜和上呼吸道，有刺激作用。 5、6.0％ PAGE 胶 40％的PA 贮存液 150ml 10× TBE Buffer 100ml Urea 420g 加超纯水至 1000ml 注： 先加入适当的去离子，搅拌溶解后，用超纯水配成1000ml。抽气过滤，4℃保存。 6、剥离硅烷（Repel－Silane） 购买于鼎国，4％二氯二甲基硅烷. 注：天气气温低时，剥离硅烷有时会有析出，涂板时会造成粘胶现象，因此当室温温度低于20℃时，要首先将剥离硅烷预热到30-40℃，玻璃要吹风机吹热才开始涂板。如果由于各种原因配完胶，凝胶会粘在玻璃板上，这时需要用1-2ml去硅化试剂用擦镜纸擦拭两块玻璃2-3min，然后用大量的水冲洗。 二氯硅烷高度宜燃和有毒，如果吸入可能会致命，因吸入、咽下和皮肤吸收而危害健康。操作时要戴合适的手套和口罩。 7、显影液的配制（使用前5小时配制） 2 水加入60 g Na2CO3 ，冷却至4℃。使用前5 min 加入37％甲醛 3ml，10mg/ml 硫代硫酸钠400ul。 注：注意安排好时间。 8、染色液（使用前10分钟配制） 2 L水加入2g 硝酸银和37％甲醛3 ml，混合后即可使用。 9、亲和硅烷（Bind－Silane） 购买于鼎国。注意事项同剥离硅烷。 10、去离子水 11、去污剂 12、乙醇 13、甲醛 注：甲醛有很大的毒性并易挥发，也是一种致癌剂，很容易通过皮肤吸收，对眼睛、黏膜和上呼吸有刺激和损伤作用。 14、甲醇 注： 甲醇是有毒的， 能引起眼睛的失明，可因吸入和咽下和皮肤吸收而受害。 15、氢氧化钾（KOH） 注：KOH－甲醇可能是毒性很高的，可因吸入和咽下和皮肤吸收而受害，其溶液有腐蚀性，操作要非常小心。 16、TEMED N, N, N’, N’-四甲基乙二胺对黏膜、上呼吸道、眼睛和皮肤的组织有极大的破坏作用，吸入可致命，长时间接触可引起严重的刺激和灼伤。 17、Tris 注： 注意Tris可因吸入、咽下或皮肤吸收而受害。 18、尿素 注：尿素可因吸入、咽下或皮肤吸收而受害。 19、KOH－甲醇溶液 在100ml甲醇中加入5g KOH配成，用于清洗玻璃板上的油渍。存储于密闭的玻璃瓶中。 注：这种溶液使用来清洗序列分析用的玻璃板的。 20、手套和口罩。无粉乳手套。 21、水浴。 |
2楼2007-10-23 23:43:12
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（一）药品配制 (二）胶的制备 1、准备制胶的玻璃和间隔片 要用 Bubble－Free凝胶。 Bio－Rad（Sequi－Gen GT） 包括两块玻璃IPC板和Outer Plate A、小心将两块玻璃板放进热水中。 B、注意要带上手套，将去污剂加入足量的并是去污剂形成粘糊状。 C、带上手套涂在玻璃板上，擦拭玻璃板，动作要求循环的环形路线。 D、用热水将多余去污剂冲洗掉。 E、用去离子水冲洗。 F、擦去多余的水。凉干。 2、重新检查玻璃板，如果去污剂的残留、干的聚丙烯酰胺残留，或者是其它的残留颗粒，必要的时候重复上面的操作。 3、在涂加硅烷化试剂的时候，要带上口罩和手套，避免吸入硅烷颗粒伤害身体。可选择的一些无毒的、无腐蚀玻璃板覆盖溶液，我们建议只对Outer进行硅化处理，应此当玻璃板分开的时候，胶就会粘在IPC－bond 玻璃板上。 用移液器吸取2 ml硅化试剂放在Front 板，用擦镜纸从上倒下按顺序擦拭，涂匀。 注意：不要对IPC板进行硅化处理，除非当硅化试剂是用hexane, 或者是heptane、或者是水溶解的，其它的有机溶剂会使IPC塑料craze或损坏，或者会使Adhesive Bond变弱。 注意不要对IPC板进行加热，它将直接对Adhesive Bond进行破坏。如果需要硅化试剂要在室温下react，cure。 提醒： 如果胶需要固定或者是染色，IPC板需要硅化处理，因为将他直接浸入固定液或者染色液是不可取的。 4、在安装玻璃板的时候加入少量的乙醇，然后用干得擦镜纸擦拭。同时用这种擦镜纸对间隔片进行擦拭， 5、如果需要除去玻璃板上的硅和旧污迹可采用KOH－甲醇溶液清洗玻璃板，小心取用KOH－甲醇溶液一定要用戴手套和口罩。 B、在温热的去污剂溶液中洗涤玻璃板和间隔板。 C、用自来水彻底冲洗。 D、用去离子水洗净。 E、用乙醇冲洗玻璃板，去掉水印，凉干。 注：玻璃板上不得留有任何油斑，以防止胶内产生气泡。 6、玻璃板处理 A、长玻璃板的处理 1、每次铺胶前均需要用亲和硅烷对长玻璃进行处理。 2、用镜头纸蘸取亲和硅烷少许（1 ml），涂在长玻璃板上。要将整块板都涂满、涂匀。 3、5-10分钟后，用95％乙醇洗长玻璃板三次，以去除多余亲和硅烷。 B、短玻璃板的处理（待定） 1、每次铺胶前均需要用剥离硅烷对短玻璃进行处理。 2、用镜头纸蘸取剥离硅烷溶液适量（1.5ml）涂在短玻璃板上，要将整块板都涂满、涂匀。 3、5-10分钟后，用干净的镜头纸擦去多余的剥离硅烷。 C、玻璃板风干后，把大玻璃板（干净面朝上）放在空的试管架上，把隔片放在玻璃板的两边。 D、再将短玻璃板放上。 （三）、操作步骤 1、在安装以前 A、完全的清洗所有的部分件。 要对universal base buffer chamber，stabilizer bar，combs，spacers和precision caster base gasket，syringe 和tubing组装在一起，用温和的去污剂在热水中洗涤。 B、准备足够的电泳缓冲液，参考下面数据： IPC size Total Buffer Required Upper lower 38×50cm 1750ml 1400ml 350ml 2、组装玻璃板sandwich A、当所有电泳的设备清洗完全以后，并且玻璃板进行了硅烷化处理，就可以组装Sequi－Gen GT设备了， 注意在所有的操作过程中要戴着手套，并且尽量避免接触玻璃的中央，只是对接触玻璃板的边缘最佳， 以防止手套的物质颗粒落在玻璃板上。 B、按着前面的说清洗硅烷化处理玻璃板。 C、将IPC平放在桌子上，间隔板的底部和玻璃板平齐，间隔板的长边应该挨着IPC panel的塑料边缘。 3、将Front（Outer long）玻璃板放在IPC和间隔板上进行硅烷化处理的表面向下。 A、用双手将IPC和Outer玻璃板（朝里面）立在benchtop上 B、使得两块玻璃板和间隔板接触benchtop，暂时将两者放在一起用来灌胶。 4、组装clamps Levers of the clamps将放在IPC一面，并且需要放在电泳玻璃板的另一面 A、检查玻璃板、间隔板和clamps的平齐度，三者的底部应该是平齐的，如果有任何一者不平齐就要进行调整。 B、将三者调齐以后移动levers向IPC使得clamps加紧。 6、为了防止在灌胶的时候combs和spacer由于不协调而出现问题，需要对梳子进行检查，将其试着放在两个玻璃板之间，如果发现有明显的不相配，就要调换comb。一般情况下，梳子应该插在两个玻璃板之间的时候稍微感觉有抵制的力量。 （四）、灌胶 注意，聚丙烯酰胺具有有毒的化学性质和神经毒性，在整个的操作过程中要戴手套和穿工作服和眼罩以及口罩。 1、 准备PA胶溶液 A、 按着下面的表格配制： IPC size 0.25mm 0.4mm 0.75mm 0.25-0.75mm 0.40-1.2mm 38×50cm 55ml 85ml 170ml 120ml 140ml B、 对胶溶液进行真空抽气5-15分钟，保证胶的有孔性。 2、 将Precision caster base放在桌子上，使它的开口向上，将gray precision caster gasket放进base里，在precision caster 里的cam pegs 必须拔出。 提醒：如果gasket是湿的，通过吸水纸积压使得gasket的水分除掉。 3、 将组装好的IPC的底边放进precision caster base使得IPC的底边接触precision caster base的gray gasket。、并且压紧。 4、 当将IPC放进base里面以后，用cam pegs将base和clamps连接在一起。 将每一个cam peg推进对应的clamp的洞里（这时候lever向上），轻轻的向下压IPC的上面使得每一个cam pegs 很好的连接。 5、 当两个pegs都连接好了，平稳的旋转直到感觉到很弱的抵制力，或者将cam pegs与benchtop垂直。这样使得precision caster base能够紧紧的和玻璃板组合在一起。 A、 将IPC平卧在benchtop，使得precision casterbase面对你自己。 B、 通过base 的injection port，向里看，如果precision caster已经很好的接触了，就会在两个绿玻璃板中间看到一个缝隙。 C、 如果看不到缝隙，通过向上旋转cam pegs 使得caster base 松开。调整caster base或者高点或者低点，直到通过injection port能看到缝隙。 D、 然后将com pegs拧回原位。 6、 将组装好的IPC和Precision caster base平放在桌子上，让IPC板向上。让clamp的长边与benchtop的边平行。 即使是最平稳的到胶也需要整个装置处于水平状态，如果不能保证水平就会有漏胶的可能。所以我们要经常的需要利用 leveling bubble来进行调整，如果需要的话可以在前面放一个小的支持物来使得整个电泳槽水平以便有利于灌胶。现在好了，就可以灌胶。 注意：如果是灌制38×50cm 的IPC，就要将38×50cm IPC放在一个斜面上使得仪器的上面要高出底层4-5cm（在仪器的底部有灌胶的precision caster base），当胶灌完以后，使整个系统处于水平状态来使的胶进行聚合。 7、 当胶正在抽气的时候，准备新鲜的10.0％过硫酸胺溶液（ammonium persulfate）。 选择合适的注射器和橡皮管组装起来。把luer taper插在橡皮管的一端，将另一端和syringe的橡胶端相连。 8、 当胶已经抽完气了，加入10％ APS和TEMED。 A、 温和的摇动溶液使之混匀。 B、 慢慢的将所需要体积的胶吸入syringe。 C、 将syringe的气泡弹到顶端，温柔的将他们推出；如果一不注意将气泡推近橡皮管，掐紧橡皮管出现气泡的位置，然后让一些胶流出，这样会使气泡随着这些胶流出。 9、 当所有的气泡从管子里赶出，将luertaper 插到injection port，将luer taper紧紧套在injecton port上，并且开始慢慢的将胶注入。 为了让胶保持一致并且没有气泡，就要求慢慢的并且均匀的推动syringer。 提醒： A、 下列的灌胶时间（从底部到顶部）将有利于形成bubble－free的胶： 50cm※0.4mm的胶需要40-45 seconds 50cm※0.25mm的胶需要50-60seconds 10seconds的注射时间或者更小将出现气泡 B、 在胶的前面容易形成气泡，因为固体区或者是不平整的不均匀的硅烷化处理。 C、 要得到bubble free的胶，要求将完全洁净的玻璃板和均匀硅烷化处理。 D、 如果气泡在胶的前端出项，稍微用力的敲打IPC的顶端（在bubble形成的上面）并且同时慢慢的注入凝胶溶液，这样就会消除气泡，如果需要的话IPC的comb可以短暂的抬起一个角，以便于消除气泡。 10、 继续缓慢的注射胶，直到胶溶液没过短玻璃上面的槽口几厘米（要使整个的 胶的上液面都超过几厘米）。 重要提示：如果是灌38×50cm IPC，移开用来产生倾斜的支持物，将胶板水平放置在benchtop上面（用leveling Bubble），另外一个2cm的支持物需要用来使得IPC水平，有些使用者发现用俩个1.5ml的离心管可以作为支持物。 当胶的溶液面超过短玻璃板，将注射器放在IPC上面直到胶完全聚合好。千万不要将luer taper从precision caster base injection port 面拔下来，否则胶就会漏出来，千万不要开始注胶以后重新调整syringe plunger。 11、 将梳子插在两个玻璃板的之间的合适的深度 A、 如果是用的sharktooth comb，插入梳子的光滑面不要超过短玻璃板5mm。 B、 然后用三个大的金属夹子夹住梳子。 C、 还可以在灌胶以前插入梳子的角使得在注完胶以后梳子很方便的插入。 12、 让胶聚合30分钟 A、 当胶聚合好以后，从precision caster base取下luertaper。 B、 Syringe tubing 和luer taper 里面的残留的胶可以用热的自来水冲洗，然后用去离子水冲洗。 13、 从IPC上取下precision caster base，清洗caster base 和gasket，方法 同上。 （五）、安装操作 1、在Outer玻璃板的外边粘贴上一个胶温度指示条，最好位于中央的位置，从而可以在电泳的过程，来检测胶的温度。 将IPC放在universal base，顶住back wall，并且卡在平齐的位置。 2、插入stabilizer bar A、固定板放的并不是很紧，只要稍微的吻合的适合就行了，这样就能使得IPC能够和base垂直了。 B、螺丝的顶端应该抵住base 的前墙，从而使得IPC clamp来抵住universal base的后墙。 提醒：如果是第一次安装Sequi－Gen GT胶槽，要调整螺丝看看是否太松或者太紧（逆时针旋转螺丝使得stabilizer bar更紧）。如果太紧就不利于将stabilizer bar的插入或者是拔出，如果是太松，stabilizerr bar就会很容易滑进或者滑出，从而不能顶住IPC靠在base 的back wall上。 3、为了防止电泳缓冲液的倾出和凝胶槽的倾斜发生事故，有必要调整universal base 下面的水平螺丝。 A、为了保证在电泳过程中防止凝胶槽的倾斜，一定要查看是否螺丝拧进螺丝槽中至少1cm。 B、在此同时，检测IPC是否和universal base平齐，加上下两个安全盖。有时候IPC不得不向左或者是向右移动。总之当最终平齐以后就取下安全盖。 4、在upper buffer chamber 里面加入1×TBE作为电泳缓冲液。 A、在整个电泳的过程中要保证电泳缓冲液的液面距离fill spout的上部不能多于1cm。 B、去掉两个玻璃板之间的梳子。 C、彻底的清洗resulting well或者胶，用一个带针的注射器或者一个塑料的移液枪头。 D、如果用的是sharktooth bomb，将梳子的牙齿插入胶的前面，然后向着胶的表面移动梳子直到接触到胶的表面。 5、在lower buffer chamber里面加入350-500ml的电泳缓冲液。 注意：不要在lower buffer chamber里面加入超过500ml 的running buffer，因为整个lower buffer chamber的容积是包含全部的upper buffer chamber 通过在电泳的过程中，漏到lower buffer chamber，如果超过500ml就不能容纳来自upper buffer chamber 的电泳缓冲液了。 6、装上顶部和底部的安全盖子，采用正常的电压对凝胶进行预电泳。参考后面的电泳电压。同时也是为了让胶达到进行正式电泳的温度。 提醒：胶的电泳缓冲液应该在微波炉里面加热到50℃，然后才能加到upper buffer chamber，这是为了减少通过预电泳来提高胶的温度的一种简单的方法。从而减少预电泳的时间。 警告：在电泳的过程中由于温度的升高，在upper buffer chamber的电泳缓冲液就会蒸发。一定要确保位于upper buffer chamber的电泳缓冲液充满，在电泳的任何时间都不能使电泳缓冲液的液面低于notched（shorter）IPC玻璃板。另外，在任何循环存在的情况下都不能使胶的温度超过60℃，过热的温度将会使的玻璃板破碎。 （六）、点样 1、关掉电源，取下上面的安全盖。 A、用带针的注射器清洗泳道，或者使用一次性的移液枪头，在点样以前（来除掉尿素）。 2、加入合适的体积的样品 Comb （red）＝0.4mm A、 样品可以通过5ul或者10ul的注射器进行加样。 B、 在加不同的样品中间要清洗针头。 C、 确保在开始电泳以前要使得上安全盖盖好。 提醒：样品的加入是凝胶分辨率的关键所在。 A、 在加样以前要彻底的清洗点样孔。 B、 直接将样品放到胶的表面。 C、 在加完样以后要马上电泳，否则样品就会扩散，影响分辨率。 （七）电泳 1、确保两个安全盖子放好了。 恒定的电压。 电泳胶的温度最好是50℃,下面作为参考 Sequi－Gen GT cell size gel thickness recommended power setting 38×50cm 0.4mm 75-80W 如果温度超过55℃就应该降低电压。 千万不要让温度超过60℃。 要周期性的检查upper buffer的液面，要保证至少高出短玻璃板1cm。 2、连续的电泳，直到期望的片段大小分离出来。通常电泳时间通过样品中的染料来指示：bromophenol blue（fast blue）或者xylene cyanol（slow blue）： Polyacrylamide Gel percentage Bromophenol blue Xylene cyanol 6％ 26base 106 base （八）拆卸 1、当期望的染料移动一定的距离，关掉电源取下两个安全盖子。 A、存在upper buffer chamber的电泳缓冲液可以通过drain port排出。 B、当connector插到drain port里时就会立刻开始导出电泳缓冲液。 2、当upper buffer chamber的液面降到drain port的时候，取出stabilizer bar，取下IPC，用吸水纸吸干IPC底部边缘的液体。然后放到附近的水槽里。 3、小心的将upper buffer chamber 残留的buffer倒入水槽中，然后小心的将lower buffer倒入合适的容器。 注意：不要在IPC中存贮电泳缓冲液，除非IPC放在clamp的正确位置，否则不能向IPC里面加入电泳缓冲液。Lever clamps为防止静止的upper buffer的压力对adhesive bond的腐蚀污染。 4、从IPC上面将clamps去下来， 首先拉 clamp使得它脱离开IPC，然后将clamps从IPC中滑出。 A、先将Sequi-Gen GT电泳槽平房在桌子上，让Outer 玻璃板 向上。 B、小心的 将玻璃板分开，轻轻的拉Outer玻璃板的靠近顶端部位。 C、当胶开始分离的时候，要小心的观察胶是粘在那一块玻璃板上，（胶 理论上应该粘在短（Short，inner，bonded）玻璃板上。 5、当胶已经粘在一块玻璃板上的时候，小心的有一张吸水纸放在胶的表面，轻轻的压滤纸使得胶在玻璃板上粘的更牢固。 6、将超出胶的多余的滤纸剪掉。 A、取下滤纸和胶，小心的提起滤纸的一端将胶从玻璃板上剥离下来。 B、将胶和滤纸放在桌子上，用保鲜膜将其覆盖，并且用剪刀将超出胶的保鲜膜剪掉。 7、胶就可以染色了。 五、染色 乙酸（1％） 显影液 2.5％碳酸钠和0.02％甲醛的水溶液每次使用要新鲜配制。 乙醇（30％） 固定液 乙醇：冰醋酸：水（30：10：60） 硝酸银溶液 每次使用时现配。 （一）、银染 1、脱色：取合适的塑料盒，倒入2升新配制的10的冰醋酸溶液（固定/停止液），轻轻摇动20分钟至胶全部脱色。 2、冲洗：用重蒸水冲洗胶板3次，每次2分钟。 3、染色：加入染色液。轻轻摇动30分钟。 4、冲洗：用重蒸水冲洗胶板不超过5分钟。 5、显影：把胶板快速的转移到2升冷却的显影液中并轻轻的摇动，直到带纹出现。 6、定影：加入等体积的固定/停止液并轻摇3-5分钟。 7、冲洗：用重蒸水冲洗2次，每次2分钟。 8、干燥：室温下自然干燥。 9、记录： |
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