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30kd&60kd的cut-off管过滤效果不佳,怎样改进?
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样品是植物叶片细胞,用0.1%sds提取液,苯酚抽提乙酸铵甲醇沉淀蛋白。 大体过程是这样的:1.鲜叶液氮研磨丙酮冲洗干净后做成干粉; 2.用0.1%sds提取液研磨提取蛋白(提取液:干粉=4ml:0.03)后70 摄氏度加热10min; 3.得到的研磨液高速离心去杂质后加入cut-off管的内管中6000转离心,分别用外管内的滤出液(A)和内管里的残留液(B)进行苯酚抽提等步骤,最后跑胶。 问题:离心后,内管底部总有黄色物质,我觉得可能会堵住滤孔,但是结果可能证明滤膜破损,因为A和B无论在单向胶还是双向胶的比较中都没有什么差异。请问是不是我使用的方法有错误,怎样改进? 在一文章里有说,将sds研磨后的蛋白1:50稀释,然后过滤。他的浓缩方法是用真空冷冻干燥机。是否是这个原因?稀释后怎样浓缩?没有冷冻干燥机…… |
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