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求助关于荧光偏正
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我想请教荧光偏正的基本原理，可以分析DNA长短的不同吗？ 有相关的文献或资料就更好啦~~可以发到我的邮箱：tudou-09@163.com 非常感谢！！ [ Last edited by bailongma on 2007-10-18 at 09:36 ] |
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leonumn
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bailongma(金币+10,VIP+0):非常感谢！！
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荧光偏振：生命科学研究领域的新宠儿 编译/张伟 北京诺赛基因组研究中心 今天，一个完全不懂得物理学知识的生命科学研究工作者可能根本没有办法完成他的科研任务。目前多种学科之间的交*、渗透和融合对生命科学研究来说具有前所未有的重大意义。‘ 世界上的任何生命活动，都具有永恒的动态性质。因此，对生命科学的研究和探索，都直接或间接的借助于研究对象中众多成分的运动规律，才能真正理解人类生命所表现的外在的多样性，最终揭开人类生命发生、发展、死亡的内在的统一法则。在生物学家不懈的探索中，我们可以发现，生命科学研究作为一种应用学科，越来越倚重于以物理学或化学为起点的各种研究方法和手段，正如本文将要介绍的“荧光偏振”。近年来，以这种物理学现象为基础的技术正悄悄地在生命科学研究的多个领域中扮演着越来越重要的角色。 理论基础 谈起荧光偏振，可能需要从偏振光开始。光由微小的波构成，光波可以在任何一个平面上均匀的振动。当其通过某些平面时，有可能因受到平面的作用将光波的能量分成不均匀的光束，振动平面也就发生了变化，可能在某一个方向的振动强或弱于其他平面，这种光称为偏振光。化学研究中常用到偏振光理论，这是因为偏振光在通过含有某种分子的溶液时，其振动性质将发生改变，如偏振平面受到扭转，根据扭转的方向和角度的变化，就能够对溶液中分子的结构作出推断。现在，将偏振光和生物学研究者的得力助手“荧光分子”相结合形成的荧光偏振理论，正在生物学分支学科理论和应用研究中大显身手。 荧光偏振应用的基础——“荧光偏振理论”也是物理课上的老话题。1926年Perrin首次在研究论文中描述他所观察到的荧光偏振现象。他发现，以一束单一波长的偏振光照射溶液中的荧光物质，后者可吸收并释放出相应的偏振荧光。如果被激发的荧光物质处于静止状态，该物质仍将保持原有激发光的偏振性；如果其处于运动状态，该物质发出的偏振光将区别于原有激发光的偏振特性，也就是所谓的荧光去偏振现象。 众所周知，任何物质都处于不断运动当中，液态环境中的荧光分子也不例外。因此当受到偏振光激发时，荧光分子的运动状态，例如旋转或翻转；荧光分子与其它因子的相互作用，例如相互结合或排斥；其所处环境的性质，例如溶液的粘度、温度等，这些因素都有可能对这个荧光因子受激发后发出的偏振光的性质产生影响。对此进行分析比较，有可能揭开物质活动的内在规律，达到研究目的。 因此，我们可以看到，以荧光偏振为基础发展的技术可用来研究生命科学中分子之间的相互作用，以及分子与所处环境——“小”至核酸和蛋白结构，“大”至整个细胞——的相互作用。相对于传统研究方法，荧光偏振技术在溶液中进行，可最大程度的模拟真实生命环境；利用它，可以实时跟踪监测分子间结合/分离的变化，并解决一直以来困扰荧光技术使用者们对于荧光无法定量的烦恼。最为重要的是，相对于一直被人们使用的放射性同位素研究方法，它更为安全可*，不会在实验过程中对研究者造成威胁，也不会产生难以处理的具有放射性的废弃物。此外，荧光偏振所需的样品量少，灵敏度高，重复性好，操作简便。在以下的应用介绍中，读者将会看到这项技术优越性的显著体现。 应用概述临床应用方面 荧光偏振免疫技术（Fluorescence Polarization Immunassay）——这是一项相对较为成熟的技术。它利用荧光偏振原理，采用竞争结合法机制，常用来监测小分子物质如药物、激素在样本中的含量。以药物检测为例，以荧光素标记的药物和含待测药物的样本为抗原，与一定量的抗体进行竞争性结合。荧光标记的药物在环境中旋转时，偏振荧光的强度与其受激发时分子转动的速度成反比。大分子物质旋转慢，发出的偏振荧光强；小分子物质旋转快，其偏振荧光弱（去偏振现象）。因此，在竞争性结合过程中，样本中待测药物越多，与抗体结合的标志抗原就越少，抗原抗体复合物体积越大，旋转速率越慢，从而激发的荧光偏振光度也就越少。当我们知道了已知浓度的标记抗原与荧光偏振光性的关系后就可以测量未知浓度的物质。因此，这项技术可用来检测环境或食品样品中有毒物质如农药的残留量。 此外，临床医学诊断也在广泛采用荧光偏振。除应用上述方法可测定人体体液样本中某一特定物质的含量外，也可直接应用于临床诊断。例如，由Cercek等开发的恶性肿瘤诊断方法中提出，进入淋巴细胞的荧光物质，受胞浆浓度有序性的干扰，其运动方向和速率会发生变化。胞浆粘度高时，荧光物质运动变慢，受偏振光激发产生的激发光与胞浆粘度低时产生的激发光性质不同。通过追踪测定激发的偏振光性质，即可了解淋巴细胞的胞浆流动性、粘度等环境的变化，结合其它辅助诊断方法，可有助于癌症的早期诊断。利用荧光偏振，还可检测病人样本中病毒DNA如HBV、HPV的复制量，为临床诊断提供有力的量化指标依据。 科研方面 从荧光偏振的理论基础可以看出，它特别适用于研究分子之间的相互作用关系，因此，越来越多的研究者开始寻找以荧光偏振为基础的研究方法来解决技术难题。目前，荧光偏振在生物学研究的应用主要有以下几个方面： 核酸结构变化研究 利用荧光偏振可帮助揭开DNA结构和结合蛋白之间的作用关系。以2003年Nucleic Acids Research发表的一篇文章为例：DNA的复制、重组、修复，RNA的转录、翻译和后处理等过程都涉及到核酸单链、双链结构的变化。解旋酶（Helicase）是双链DNA解链的动力蛋白，它以单向运动在DNA双链上变换位置和核苷酸相结合，通过DNA上核苷5’三磷酸获得ATP能量水解双链DNA配对碱基间的H键。研究发现，以荧光标记寡核苷酸，后者可高度自由旋转，因此受到偏振光的激发后发出的激发光偏振性很低。解旋酶-寡核苷酸复合物分子量大，旋转速度低，激发光的偏振性高。随着复合物的解体，高的偏振信号急剧减弱。因此，这种方法可结合动力学研究，通过偏振信号的变化对DNA双链形成和解链过程进行实时监测，灵敏度高，方便迅速。此外，这种方法也应用于其它蛋白与DNA结合的研究中（见图1）。 蛋白激酶活性研究 人体细胞内的蛋白激酶可以对细胞外调节因子和环境变化做出反应，使细胞活化、生长和分化，转录调节、免疫应答等的重要调节因子。人们普遍认为蛋白激酶的错误表达和功能发挥失常是造成人类多种疾病的原因。因此，长期以来，研究者致力于蛋白激酶结构和作用机理的研究，生物制药业更是将蛋白激酶和蛋白激酶抑制剂作为小分子药物研究的热点。 Panvera开发了一种基于荧光偏振的蛋白激酶活性试剂盒，可方便快捷的进行蛋白激酶抑制因子和筛选工作。其工作原理如下：将磷酸化底物进行荧光标记，与由蛋白激酶产生的未标记磷酸化产物抗丝氨酸抗体相竞争结合。当反应液中没有蛋白激酶产生的磷酸化产物时，荧光标记物与抗体相结合，因复合物体积较大，运动速率较小，受偏振光激发后产生的激发光具有较大的偏振值；当反应液中含有蛋白激酶产生的磷酸化产物时，因二者竞争抗体的结合位点，较少的荧光标记物结合到抗体上去，自由的荧光标记物在反应液中增多，发出的激发光偏振值减小。因为蛋白激酶的活性越大，产生的磷酸化产物越多，与荧光标记物的竞争越激烈，对标记物产生的激发光的性质影响越大，因此偏振的改变直接与蛋白激酶的活性相关。这种分析简单，易于应用，可很好的适用于高通量的筛选工作（工作原理见图2）。 SNPs筛选 SNPs是指人类基因组中普遍存在的个体之间相互区别的碱基变化位点，称作单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphisms）。人们普遍认为，SNPs是人类个体之间相互区别的原因，也和多种疾病发生、变化相联系。长期以来，SNPs位点的快速筛选需要大量的基因分型工作，花费巨大，是工作进展的最大障碍。现在，研究者可以采用荧光偏振为基础的FP-TDI技术（fluorescence polarization template-directed dye-terminator incorporation）进行高通量单核苷酸多态分型，操作简单，投入少。 实验过程中先通过PCR获得含有SNP位点的一条扩增产物，针对这条含有SNP兴趣位点的序列设计一条寡核苷酸探针，在DNA聚合酶和荧光标记的ddNTP存在下，探针单碱基延伸。特定的ddNTP将结合到靶序列的SNP位点，并造成延伸反应的终止。自由的标记有荧光的ddNTP比结合到靶序列的ddNTP体积小，在液体环境中旋转速度快，激发的偏振光的偏振值也小，而后者当ddNTP加到序列上后，有效分子体积变大，受偏振光激发后发出的偏振值高。因此，荧光偏振现象可以应用在鉴别ddNTP的结合位点和基因分型。 目前，荧光偏振技术在生命科学研究领域的应用并不局限于以上几个方面，以荧光偏振为基础已经衍生出多项相关技术。受篇幅所限，本文只是将荧光偏振在目前研究领域中热门方向中的应用和原理作了一个简单的介绍。相信随着学科间的不断交*、融合和这项技术的优化与推广，它将受到研究者越来越广泛的关注，在更多的研究领域发挥其重要作用。 |
3楼2007-10-20 15:46:28
没有人知道么？ 2楼2007-10-20 13:09:34
