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zhangdapeng

木虫 (著名写手)

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[求助] 细胞污染

大家好！由于实验条件有限，只能在一般的实验室中培养细胞，并且自己以前是学化学的对细胞培养这块不了解，前几天养了昆虫细胞Sf9，结果被污染了，也不知道是什么原因，看了网站上一些贴子，因此想问大家怎么去检测或采用什么方法来判断细胞是细菌污染、支原体污染、病毒污染？

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1楼 2013-06-06 13:56:34

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阿飞1990乖乖

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
wizardfan: 金币+3, 很详细的回答 2013-06-07 08:44:16

二、污染的鉴别
1、细菌、真菌污染的检测
（1）肉眼观察  细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且增生迅速，若有污染，在48小时内可明显观察到。如培养液变混浊，或略加振荡有很多漂浮物漂起。
（2）镜下观察  在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染。若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。
（3）接种观察  采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可发现是否有污染。
2、支原体污染的检测
（1）相差显微镜观察  将细胞接种于事先放置于培养瓶内的支持物(一般用长形盖玻片)，24小时后用清洁尘镊子从培养瓶中取出支持物，细胞面向上放置于载物片上，再盖上较大盖玻片，用相差油镜观察；若不用支持物培养法，直接取少许培养液滴在载物片上，再盖上盖片观察亦可。支原体在镜下呈暗色微小颗粒，多位于细胞与细胞之间，有时可见类似于布朗运动的表现。应注意与细胞破碎溢出的内容物如线粒体等相区别。
（2）荧光染色法观察  用荧光染料Hoechst33258，此染料能与DNA特异地结合，可使支原体内的DNA着色，然后用荧光显微镜观察。染色方法为：用支持物盖片培养法将细胞接种在盖片上，在细胞汇合前（即未长满前）取出玻片，于碟皿中，用不含酚红的Hanks液漂洗，1:3醋酸钾固定10分钟，再用生理盐水漂洗后置于50μg/mL的Hoechst33258(生理盐水配制)中染色10分钟，置于蒸馏水漂洗1～2分钟，向细胞面滴加数滴pH5.5磷酸缓冲液，然后置荧光显微镜下观察。若用细胞培养液，先离心去除上清液，再加入Hanks液漂洗，离心弃上清后加入1:3醋酸甲醇固定10分钟，再用生理盐水漂洗后去上清液，再用Hoechst33258，DAPI或者PI等核染色试剂，染色10分钟，加入蒸馏水漂洗，离心去上清蒸馏水，加3～5滴pH5.5磷酸缓冲液，稍吹打使沉淀细胞重悬浮，用吸管吸出，滴于载物片上，盖上盖片后观察。荧光显微镜下支原体呈绿色小点，散在于细胞周围或附于细胞表面。
（4）电镜检测可用扫描电镜或透射电镜观察。一般在细胞培养48～72小时，细胞接近汇合前，用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行。需经过固定、包埋、切片后才能进行观察。详细方法同细胞形态观察法。
（5）培养检测  将2.5×109/L细胞悬液5mL加入45mL支原体肉汤培养基（Sigma或北京生物制品所生产的均可），培养14天后观察肉汤培养有无雾状沉淀，然后取0.5ml加入已冷却到50℃的培养基中，再用琼脂培养基做分离培养，37℃培养3天观察有无“荷包蛋”菌落出现。
* 培养加荧光核染色是检测支原体污染的黄金搭档。
污染的预防
预防是防止细胞培养过程中发生污染的最好办法。只有预防工作做在前，才能将发生污染的可能性降到最小程度。在超净台中进行细胞培养时，特别注意在进行移液，倾倒液体的操作过程会产生飞沫并沉积在超净工作台内物体的表面。超净工作台的气流并不能阻止飞沫的产生，飞沫会随着气流的方向飘浮。超净工作台不合理的放置、不恰当的维护以及不规范的使用会破坏超净工作台气流的方向导致飞沫更广泛的沉积。酒精灯的火焰、操作者的活动、谈话、咳嗽及打喷嚏都有可能影响气流。飞沫的沉积是导致超净工作台内物品污染的主要因素造成潜在污染的进一步传播。因此为减少交叉污染的发生，应尽可能减少超净工作台内的物品。不同细胞系以及同一个实验室不同操作者所使用的培养试剂一定要分开使用，如胰酶、培养液等。否则，一个操作者的失误可能引起所有细胞发生污染。污染的鉴别
1、细菌、真菌污染的检测
（1）肉眼观察  细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且增生迅速，若有污染，在48小时内可明显观察到。如培养液变混浊，或略加振荡有很多漂浮物漂起。
（2）镜下观察  在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染。若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。
（3）接种观察  采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可发现是否有污染。
2、支原体污染的检测
（1）相差显微镜观察  将细胞接种于事先放置于培养瓶内的支持物(一般用长形盖玻片)，24小时后用清洁尘镊子从培养瓶中取出支持物，细胞面向上放置于载物片上，再盖上较大盖玻片，用相差油镜观察；若不用支持物培养法，直接取少许培养液滴在载物片上，再盖上盖片观察亦可。支原体在镜下呈暗色微小颗粒，多位于细胞与细胞之间，有时可见类似于布朗运动的表现。应注意与细胞破碎溢出的内容物如线粒体等相区别。
（2）荧光染色法观察  用荧光染料Hoechst33258，此染料能与DNA特异地结合，可使支原体内的DNA着色，然后用荧光显微镜观察。染色方法为：用支持物盖片培养法将细胞接种在盖片上，在细胞汇合前（即未长满前）取出玻片，于碟皿中，用不含酚红的Hanks液漂洗，1:3醋酸钾固定10分钟，再用生理盐水漂洗后置于50μg/mL的Hoechst33258(生理盐水配制)中染色10分钟，置于蒸馏水漂洗1～2分钟，向细胞面滴加数滴pH5.5磷酸缓冲液，然后置荧光显微镜下观察。若用细胞培养液，先离心去除上清液，再加入Hanks液漂洗，离心弃上清后加入1:3醋酸甲醇固定10分钟，再用生理盐水漂洗后去上清液，再用Hoechst33258，DAPI或者PI等核染色试剂，染色10分钟，加入蒸馏水漂洗，离心去上清蒸馏水，加3～5滴pH5.5磷酸缓冲液，稍吹打使沉淀细胞重悬浮，用吸管吸出，滴于载物片上，盖上盖片后观察。荧光显微镜下支原体呈绿色小点，散在于细胞周围或附于细胞表面。
（4）电镜检测可用扫描电镜或透射电镜观察。一般在细胞培养48～72小时，细胞接近汇合前，用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行。需经过固定、包埋、切片后才能进行观察。详细方法同细胞形态观察法。
（5）培养检测  将2.5×109/L细胞悬液5mL加入45mL支原体肉汤培养基（Sigma或北京生物制品所生产的均可），培养14天后观察肉汤培养有无雾状沉淀，然后取0.5ml加入已冷却到50℃的培养基中，再用琼脂培养基做分离培养，37℃培养3天观察有无“荷包蛋”菌落出现。
* 培养加荧光核染色是检测支原体污染的黄金搭档。
污染的预防
预防是防止细胞培养过程中发生污染的最好办法。只有预防工作做在前，才能将发生污染的可能性降到最小程度。在超净台中进行细胞培养时，特别注意在进行移液，倾倒液体的操作过程会产生飞沫并沉积在超净工作台内物体的表面。超净工作台的气流并不能阻止飞沫的产生，飞沫会随着气流的方向飘浮。超净工作台不合理的放置、不恰当的维护以及不规范的使用会破坏超净工作台气流的方向导致飞沫更广泛的沉积。酒精灯的火焰、操作者的活动、谈话、咳嗽及打喷嚏都有可能影响气流。飞沫的沉积是导致超净工作台内物品污染的主要因素造成潜在污染的进一步传播。因此为减少交叉污染的发生，应尽可能减少超净工作台内的物品。不同细胞系以及同一个实验室不同操作者所使用的培养试剂一定要分开使用，如胰酶、培养液等。否则，一个操作者的失误可能引起所有细胞发生污染。