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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 基因敲除
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499649610

金虫 (小有名气)

[求助] 基因敲除 已有1人参与

最近做细菌（革兰氏阴性菌）的基因敲除，利用同源重组的方式（双交换），请问我设计左右同源臂至少应该多长，左右同源臂是一样长好还是不一样长好？求指导！我有设计一边500多，一边260的样子，是否可行？求指导!还有，做敲除的注意事项能否告知！（我用的质粒是自杀性质粒，不引入抗性基因）
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1楼 2013-06-04 16:12:44
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志子

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+5, MicEPI+1, good，回答的很全面 2013-06-07 09:18:59
非特异性回答，具体情况具体分析，仅供参考。
利用同源重组构建基因敲除的基本步骤：
a． 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
b．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。
ｃ．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。
ｄ．选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的重组概率为10－2～10-5，植物的概率为10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。目前常用的方法是正负筛选法（PNS法），标记基因的特异位点表达法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法。
ｅ．表型研究：通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。
f．得到纯合体：由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传.
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2楼2013-06-05 10:31:12
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海骄子

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
关键你的左右臂是否有合适的酶切位点，适合载体的构建！
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3楼2013-06-06 14:53:16
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499649610

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 海骄子 at 2013-06-06 14:53:16
关键你的左右臂是否有合适的酶切位点，适合载体的构建！

我已近吧同源臂连接到载体上了 这个载体有人做过同一个属到菌株的基因敲除
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4楼2013-06-06 23:10:07
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stliimoon

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议你看看相关RED同源重组的文献资料，我只做过大肠，同源臂只有50 bp左右就可以了。
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5楼2013-06-07 10:21:34
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muchong5577

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

楼主，这个希望对你有用：
http://pan.baidu.com/share/link? ... p;amp;uk=4228042296
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6楼2013-06-08 09:51:52
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499649610

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by muchong5577 at 2013-06-08 09:51:52
楼主，这个希望对你有用：
http://pan.baidu.com/share/link?shareid=337853829&uk=4228042296

谢
7楼2013-06-14 22:27:37
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梅在在

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

请问是用的什么自杀质粒？我也在做阴性菌的基因敲除，找不到合适的自杀质粒呢
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8楼2014-05-16 16:07:34
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