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[求助]
包涵体复性
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| 包涵体过镍柱，并进行了尿素梯度透析，6M-0M，请问一下，梯度透析之后尿素能除净吗，怎么鉴别尿素是否除净，蛋白是否复性成功？之后要做抑菌试验的，尿素一定要除去的。希望大家给点意见。 |
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qianshengguo
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2楼2013-05-22 14:22:58
会思想的芦苇
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3楼2013-05-22 14:40:25
【答案】应助回帖
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小虫子MM(amisking代发): 金币+4 2013-05-22 21:40:12
小虫子MM: 金币+11 2013-05-25 15:49:06
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小虫子MM: 金币+11 2013-05-25 15:49:06
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楼上几位说的都很有道理！ 我不知你倒数第二步的Urea浓度是2M，还是1M？ 打个比方，假如你倒数第二步的Urea浓度是1M！你蛋白的体系是20ml，你0M Urea的buffer是2L！ 1）.假如你将20ml含1M Urea的protein复性到0M Urea的buffer 2L中！你可以计算一下，你最终体系中的Urea含量应该是10mM! 2).假如你将20ml含1M Urea的protein复性到0M Urea的buffer 1L中，到体系内外达到平衡后再复性到0M Urea的buffer 1L中！（也就是换液一次！）你最终Urea的浓度被稀释50*50=2500倍！也就是最终含有0.4mM的Urea！ 建议你复性的时间长点！一天或者更长（只是针对比较复杂的蛋白复性来说）！一般蛋白复性6~7h就够了！ 并不是所有蛋白复性都需要加Arg和GSH氧化还原系统！有的蛋白在PBS等缓冲体系中就能复性！不需要添加任何稳定剂的！你添加Arg是增加了protein refolding 的中间结构的稳定性！但也避免不了你又引入新的干扰因子！Arg可能对你做科研实验有一定的影响！所以能不加就不加！！！ 氧化还原系统只是针对还有二硫键的蛋白的renaturation有作用！如果你的protein不含有巯基怎么办呢？那不是又白加了吗？？？？（好吧！我扯得太远了！！  ）希望以上建议对你有用！ |
4楼2013-05-22 18:55:07
志子
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5楼2013-05-22 21:37:40
不知道哪步出问题了！请大侠帮帮忙！ 6楼2013-05-24 09:02:48
生物小通
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【答案】应助回帖
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来学习的，我们也做变性复性的，如果是复性抗体的话，是否成功好检测，但是其他的就不清楚了。根据我们复性抗体知道复性是非常困难的。 第一，复性条件要具体情况具体分析，尤其是有二硫键，氧化还原系统的比例要具体分析并控制。 第二，复性成功率，即便是能够找到复性的条件，但是复性成功率依旧是个问题，好似一般的在20%左右，当然这个跟蛋白的关系很大。 第三，透析浓缩，你在变性复性、透析浓缩中，随时间推移，蛋白质自身就会失活，尤其是在透析浓缩中，因为蛋白浓度降低，本身失活，透析并不是无菌环境，因此会降解。时间越久，损失越大，可以通过SDS-PAGE分析蛋白降解问题。 由上面可以知道，我们这种研究所，一般没有特别优秀的老师指导及特殊设备复性，真正成功并获取活性的蛋白会非常非常小（当然这个一般的蛋白在无特殊设备的情况下很难确定是否复性成功）。 我是用的可溶性表达，建议以可溶性表达进行优化表达条件，或者换载体之类的。这种成功的可能性更大。 |
7楼2013-05-24 09:32:20
8楼2013-05-24 11:30:10
lwj861228
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9楼2014-07-14 08:47:11
