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生物工程学考试题
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生物工程学考试题 反向PCR、反向聚合酶链反应：用适当的限制性内切酶裂解含核心区的DNA，以 产生适合于PCR扩增大小的片段，然后片段的末端再连接形成环状分子，从而将边 侧区域转化为内部区域。PCR的引物同源于环上核心区的末端序列，但其3'端趋向 未知区域，其方向性使链的延长经过环上的未知区而不是分开引物的核心区。 典型的PCR扩增使用与互补链杂交的寡聚核苷酸引物。引物是定向的，使延伸向内 跨过两个引物之间的区域。一个引物的DNA合成产物作为另一个引物的模板，进行 DNA变性、引物退火，DNA聚合酶管伸反应的多次重复性循环，可使引物规定区域的 拷贝数成指数增 加。但用传统PCR方法得不到紧邻引物外侧的DNA序列，因为寡聚 核苷酸所引导的既有目的DNA又有引物外侧区的DNA合成在拷贝过程中只呈线性增长 ，这种线性增长是因为，对于每种引物来讲，其不能引导DNA反向合成(3'-5'). 反向PCR的应用：边侧区域的扩增；末端特异探针的制备；序列的易位、 转座和基 因融合；测定未知边侧序列。 主要优点是简单快速，可以研究许多独立克隆。其某些应用适合于临床诊断。 局限：一是由未知边侧序列性质引起的，需用几种酶试验以选择产生 大小合适的 片段的内切酶；二是许多常用内切酶也在不适当位点裂解载体序列。但一旦确定合 适的内切酶，反向PCR方法是直接了当和可靠的。 思考题（刘进元） ★1 棉纤维细胞发育分为哪四个时期？设计出克隆棉纤维细胞特异表达基因(全长 )的实验方案?（不考？） ★★2 Real-time PCR与普通PCR的异同点？ 实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实 时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 相同点：反应原理、反应体系、反应条件和反应步骤基本相同； 不同点：荧光PCR不同于其他PCR的地方在于PCR过程中利用荧光染料在光刺激下释 放的荧光能量的变化直接反映出PCR扩增产物量的变化，荧光信号变量与扩增产物 变量成正比，并通过足够灵敏的自动化仪器实现对荧光的采集和分析以达到对原始 模板量定量的目的。 荧光PCR区别于其他PCR方法主要有以下优点： 1) 全封闭反应，PCR产物污染少，操作快速，无需PCR后处理 2) 特异性强，假阳性率低,灵敏度高 3) 采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确 4) 定量范围宽，可达到10个数量级 5）开放式平台：可以用不同的染料、多重多种PCR对不同的分子分析 6) 仪器在线式实时监测，结果直观，避免人为判断，结果可靠 7) 可实现一管双检或多检 8) 程序化界面，操作简便、安全，提高效率 9) 利于自动化和联网管理 |
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