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[资源] 细胞活性测定方法专题讨论

细胞活性测定方法专题讨论细胞活性测定方法专题讨论

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plantsoil

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细胞活性测定方法专题讨论
转载请注明来自丁香园
发布日期: 2006-08-01 20:18  文章作者: 丁香园集体创作  
文章来源: 丁香园  文章编辑: bluelove  
关键词: 细胞培养 活性测定 台盼蓝染色法 克隆形成法 3H放射性同位素掺入法 MTT法  

网友[cox_1]：

最近做过些细胞活性的测定，用过MTT，也用过CCK-8：
MTT：步骤有点烦琐，中间有吸液的步骤会造成不可避免发生误差，特别是加DMOS前的一步，会吸走不少的结晶，后来改进了方法，用2%SDS-HCL溶结晶，不需要去培养基，但是必须37度过夜，耗时比较长。另外MTT反应，这一步，至少需要3小时，如果要做某个药物的急性作用，用这个方法就不太好了。
CCK-8：是MTT的改进，步骤简单，中间不需要吸出孔内的培养基，这样就减小了误差，另外CCK-8反应时间也短，最短1个小时就够了，特别适合做急性作用。缺点是有点贵。

我的疑问是：
1、不管是MTT还是CCK-8，原理基本是一样的，都是发生反应生成有色物，只不过一个是难溶于水的晶体，一个是直接溶于水的。我的问题是，如果做急性作用，是不是可以再缩短反应时间（当然OD值不能太小）？比如，缩短至半小时？另外，最后所测得OD值应该是MTT或CCK-8反应时间内细胞活性的综合反映吧？
2、平行孔的OD值，最科学的分析方法是怎样的？ 有的人把平行孔相差很大的值去掉，只保留比较接近的值，理由是：相差很大的值，很可能是操作带来的较大的误差，不可信。我个人觉得，这样做不科学，但是也找不到很好的解决办法。还希望各位给点意见。

网友[twoicedragon]：

首先感觉MTT最好现用现配，使用时避光，虽然有资料说可以长期4度存放，但觉得时间久了还是很容易出问题！另外就是最后一次加药或换液要用无血清的培养基，我的经验就是血清对结果的干扰还是很大的！还有就是做实验的复孔要尽可能的多！我的每次都要做几十个复孔才能保证实验结果！

总之自我感觉这个实验方法虽然很简单，但要出好的结果还是蛮难的！对照组一定要设置全！这个才能出了好点的结果！

网友[shuaih]：

我做过alamar blue ，MTT，台盼蓝，感觉上，台盼蓝可以分辨出死细胞，但是计数不如其他两种精确；MTT反应产物停留在细胞内，必须破坏细胞膜才能检测，可以用DMSO＋SDS＋HCL或醋酸 配置破膜溶液，效果一直很好，但是由于细胞死亡，无法进行后续检测，最多只能同时测培养基里面的物质如ALP等，所以要求很多样品数才能做完其他检测方法，还有一点就是，MTT的反应产物总是同时存在于细胞内和培养基中，这对实验结果有一定影响，造成MTT的可重复性不佳。alamar blue，则对样品数要求相对少，因为alamar blue 的产物resorufin是可溶的，可以检测培养基里面的resorufin而不必破坏细胞，但是由于resorufin是偏红色的，所以只能用无酚红培养基，对培养的时间要求也相对MTT来说要苛刻，还有一点就是alamar blue的花费也较高。

网友[dabao]：

我以前曾参与研究开发一种天然来源的免疫抑制剂。该物质被证明主要是由多肽类物质组成。我们以3H-TdR参入法测定免疫抑制剂对PHA诱导的人外周血淋巴细胞（PBL）转化的影响，组分活性以对PHA诱导的人PBL转化的抑制率表示。

具体步骤是：

将待测样品用RPMI-1640培养液稀释成一定浓度。以无菌手续采集3人份静脉血，每1ml加10u的肝素钠抗凝。取24孔培养板，向每孔内加人外周血0.1ml，对于每个人的血样做3个重复孔。向每孔内加入含10%小牛血清的RPMI-1640培养液1ml、PHA应用液0.1ml。试验孔加样品液0.1ml，对照孔加RPMI-1640培养液0.1ml，加盖后在CO2培养箱中于5% CO2、37度条件下培养48h，加入浓度为3.7×105Bq/ml （10uCi/ml）的3H-TdR 0.1ml，混匀后继续培养24h，用49#玻璃纤维膜收集淋巴细胞，用液体闪烁计数器计数每分钟的闪烁次数（cpm）。将每个人3个重复试验孔cpm的平均值作为试验样品作用于该人血样后的cpm值，按下式分别计算样品对PHA诱导的每个人PBL转化的抑制率：
抑制率（%）=（1－实验组cpm/对照组cpm）×100%
以3个人血样抑制率的平均值作为样品的活性。

该试验重现性很好，结果也较为可靠。
但是个人感受是“都快怕了”做这个试验了。首先是放射性，莫名；然后是细胞试验本身（细胞是人源原代，本人当然首当其冲是第一个志愿者；原代培养本身也有点），当然，这与该测定细胞活力方法本身无关；再次是时间较长；还有在自己单位不能独立完成，需要很多特殊设备。

网友[楚布衣]：

对细胞增殖实验来说，MTT、CCK-8和3H-TdR 我都做过。感觉是前者便宜、步骤烦琐、对实验技能要求大，否则误差较大、敏感度在三者中最低。CCK-8稍贵一点、步骤简单、稳定性不错、敏感度介于两者之间。3H-TdR 敏感性最好、但步骤较多、需要特殊设备，最大的问题是有放射线。 所以综合评价，我们觉得CCK-8简单、稳定、敏感性好、安全、价钱还能接受，所以现在细胞增殖实验主要用CCK-8来做，敏感性要求特别高的就用3H-TdR （没有小孩的、女性的一般还是避免用3H-TdR ），而MTT主要用来做学生实验。

网友[lillyjin]：

我的实验用过台盼蓝染色、MTT、CCK-8。我分离的是病人的淋巴细胞，经不同浓度的药物处理后，检测细胞增殖变化，台盼兰染色可以发现药物抑制细胞增殖是因为药物作用还是浓度大引起的毒性反应。可以发现较大的浓度药物经台盼兰染色后活细胞比例低。大部分文献对淋巴细胞增殖测定方法，用的是3H-TdR。我们实验室的这种仪器坏了，我查阅做淋巴细胞也有人用过MTT法，所以一开始我用MTT算是一个预实验，测定细胞增殖能力如下：培养的淋巴细胞浓度为1×106/ml、200μl/孔加入平底96孔板，设三个复孔，再加浓度为5mg/ml的MTT，25μl/孔，CO2下孵育4小时；1500r/min离心后轻轻吸出150μl/孔上清，再加入150μl/孔的二甲基亚砜，静置10分钟后在酶联检测仪上（570nm）测定吸光度（A，曾称光密度OD）；用每组三个复孔A值的平均值来比较，A值高，则增殖快。但是结果不理想，可能淋巴细胞为悬浮生长，MTT中间环节多，容易吸出细胞，结果不稳定．后来看过CCK－8的资料，就试着用用，跟MTT相比，步骤简单，省时省力，缺点当然是比MTT贵多了。每次的结果稍有不同，统计学还是有意义的，主要经验体会是：细胞量要够大。至少每孔保证105的量，其次要充分混匀，最好在摇床上摇荡几分钟．孵育时间要摸索，淋巴细胞在48小时的结果最好。

网友[ichi_only]：

XTT法
XTT{2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulphenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide}是MTT的一种衍生物，可被活细胞线粒体的脱氢酶还原产生水溶非细胞毒性的Formazan产物而显色，显色程度与活细胞数成正相关。主要优点是反应产物为水溶性，对贴壁和悬浮生长的细胞均适用，检测时间缩短和处理步骤减少，但本底较高，重复性受pH的影响，其它与MTT法相同。

此外还有MTS法
MTS[3-(4,5-diethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-etrazolium,inner salt]为新一代四氮唑蓝盐化合物，其被还原形成的Formazan产物水溶性和稳定性更高，显色更快。

网友[fird]：

其实直接计数法也是一种非常好的方法，至少比MTT来得准确。

首先在10cm的Dish中接种1000-10000个细胞，然后培养1周至2周，消化后，进行计数。此法简单易操作，也非常公认，主要是依靠时间来放大不同处理组的差异，原理与clone formation assay 差不多。

此外，BrdU掺入法也是不错的检测细胞增殖的好方法，原理3H放射性同位素掺入法一样，但可以不接触同位素，用荧光显微镜或FACS即可检测。

网友[mjpl04]：

H3掺入试验、MTT比色法、XTT比色法都属于测定淋巴细胞体外增殖反应的方法吧。我最近也要做关于这方面的实验，就把师兄介绍的测细胞增殖反应时应注意的问题说一下吧：
1、丝裂原的质量和活性是测定淋巴细胞增殖反应的关键因素。因此在实验前，应确定其最佳刺激量。
2、检测T细胞增殖反应，丝裂原用PHA或ConA；B细胞增殖反应用LPS或SPA；T、B细胞增殖反应用PWM。
3、增殖反应的细胞应保持高活性，一般应〉=95%。应用单抗分离制备的反应细胞因保存剂（如NaN3）或抗体的直接作用可抑制细胞的增殖。此外，增殖细胞的浓度过高或过低均不利于细胞生长。
4、细胞培养液应无菌、无支原体污染，特别是小牛血清加热灭活补体，避免LPS或其他能促进细胞增殖物的污染。因此，实验前应选择本底低的小牛血清。用人“AB”型血清或自体血清也应加热灭火补体。

网友[泡泡游]：

LDH释放法
酸脱氢酶（LDH）在胞浆内含量丰富，正常时不能通过细胞膜，当细胞受损伤或死亡时可释放到细胞外，此时细胞培养液中LDH活性与细胞死亡数目成正比，用比色法测定并与靶细胞对照孔LDH活性比较，可计算效应细胞对靶细胞的杀伤%。本法操作简便快捷，自然释放率低，可用于CTL及NK细胞活性测定及药物、化学物质或放射引起的细胞毒性，现已有LDH法测定CTL活性试剂盒（promega）。应注意较高浓度FCS中所含LDH可能干扰结果。

51铬（Cr）释放法，本法结果准确、重复性好，但也存在以下不足：①使用放射性的51Cr不利于安全操作及废物处置，且需特殊测定仪器；②51Cr自发释放率高，常因不同靶细胞标记效率变化差别大而影响结果判定；③51Cr半衰期（27.8天），无法用于需多次测定的动物试验；④细胞共育时间短而试验操作步骤多，不能在单个细胞水平进行测定。

荧光测定法：
如： alamarBlue一步荧光测定法
alamarBlue为活细胞代谢指示剂，易溶于水，进入细胞后经线粒体酶促还原产生荧光及颜色变化，可用以定量。具体测定方法是：在靶细胞孔（T）、效应细胞孔（E）和实验孔（T+E）各加alamarBlue，共育6～24h后用板式荧光测定仪测530nm（发射）/590nm（散射）波长荧光强度，将T及E孔荧光均值相加后减去实验孔（T+E）荧光均值，与T孔荧光均值比较即可计算CTL对靶细胞的溶解%。本法与51Cr释放法纺织厂较有以下特点：①特异性相当但灵敏度更高，重复性好，组内及组间差异很小。②使用方便，无需预先标记靶细胞及离心和洗涤步骤，适用于大批量样品的高准确性自动测定。③alamarBlue的使用浓度不影响细胞正常代谢及基因表达，可在无菌条件下测定后继续培养扩增细胞，有利于对培养细胞的连续监测及深入研究。④还可测定淋巴细胞增殖或化学物质的细胞毒性及细胞凋亡。⑤多种粘附或非粘附细胞系、细菌、真菌等可用作靶细胞，所需效应细胞数较少（3×105/孔即可）。⑥含胎牛血清（FCS）及酚红的培养液也不干扰测定结果。

网友[大灰熊]：

用MTT法中的一些体会：
1、细胞数要尽可能的多，在细胞数足够多的情况下，可以避免一些上述园友提及的一些误差。
2、要有足够多的复孔，我一般每个剂量设8个复孔。我做了100多块板子后发现只要有足够的细胞数和复孔数，MTT法的重复性还是可以的。前几天测了几种物质对细胞活性的影响，基本上和我在2年前测得结果一致。

总之，我觉得统计学中关于试验设计中要有足够的样本数很重要，大样本数可以极大降低实验中的误差，增强实验结果的可靠性和重复性。

网友[littlenoodle]：

我们课体组是在2004年使用的CCK-8试剂盒，检测原代分离的小鼠T淋巴细胞增殖。之前也使用过[3H]-TdR和MTT法，但由于原代T细胞的特点：1、细胞为悬浮；2、细胞体积小；3、原代细胞存活和增殖较细胞系困难。并且实验中涉及功能阻断，所以我用MTT的精确性不够高，多次用[3H]-TdR考虑到安全性不够好。就改用了CCK-8检测增殖。

我使用96孔细胞培养板，每孔4×105 个T细胞，PHA或ConA加入活化细胞后检测，每孔20μl，注意不要产生气泡，防止影响读板，因为这些小泡即使用针尖也无法消除。放回培养箱，4 h后取出，酶标仪550nm读板，虽然要求的是450nm，但我室没有安装这一波长的滤光片，所以就用了550nm，从结果上看趋势还是很好的。

保存：由于买的量大，所以为维持产品稳定性，先将不用的都保存在－20℃，并且使用过程中尽量避光，用完立即放回4℃。

另外，在培养贴壁细胞（如星形胶质细胞）的过程中，加CCK-8之前可先用水平式离心机去除培养基，加入含10％CCK-8的培养基,培养30 min后检测。这种方法在没有多道移液器，可能导致加入的CCK-8量不同的情况下可供使用。在加入CCK-8后不同时间检测，数值会有所升高，但总的趋势不会变。另外，要像做ELISA一样，在培养板上设立各种严格的对照组，每组3孔，以便去除本底，做出准确的变化曲线。

但所有细胞的活力要求必须要好，否则不增殖，测不出太大的变化。

网友[spiderman020389]：

做MTT之前，要首先就你所要做的细胞，不加药的情况下，测定细胞作用的时间以及不同细胞数情况下，检测出其OD值，使你的OD值在0.75－1.25之间，也就是找出最优的时间点和细胞数。同样在实验过程中还要注意MTT避光，避免污染，培养基污染，以及细胞数过高过低现象及复孔（我实验过程中每浓度设置了10复孔），好多的细节需要注意，尽管是一个不太杂的实验。

网友[樱桃子]：

1、感觉MTT方法所得出的结果重复性不太好，虽然多次试验的总体趋势是一致的，但每次得出的IC50值相差挺大，结果标准差也相差很大。
2、改用CCK-8，感觉操作步骤简单，这样就减少了操作产生误差的机会。结果也稳定了许多。
3、我个在使用CCK-8中得出的很重要的经验是：如果待测培养系统（如药物）本身是有色的，特别是黄色，那么一定要注意设好对照。因为CCK-8生成的产物也是黄色的，这样会干扰实验结果。设立对照方法如下：
细胞对照孔：细胞+培养液
药物对照孔：药物+培养液 各浓度组药物都要分别设立
培养液对照孔：用于整块培养板调零
4、如果想发SCI的文章，还是选用国际上承认的方法，现在好像MTT发SCI有点悬。

网友[hotgray]：

我做MTT 做了很多，只要你每次的条件摸的差不多，MTT 的准确率还是可以的，虽然每次测得同一个孔的值，都不一样，但是IC50值，差别不大的。我的经验就是要把，孔的倍数拉开，这样就容易形成剃度，IC50值就比较稳定了。之后在在大致的范围内，缩小倍数 ，多次测，可以得到一个可靠的IC50值。

网友[haizhitang]：

我用CCK-8检测原代大鼠肝脏细胞。
实验方法：
1、分离原代大鼠肝脏细胞，以3×105/ml浓度将细胞铺于96孔细胞培养板中，贴壁培养。
2、贴壁培养4小时后，加入待测药物，作用相应时间。
3、每孔加入10ul CCK-8溶液，放入细胞培养箱中继续培养3－4小时，450nm读取吸光值。

注意事项：
由于是贴壁培养的细胞，在读吸光值时细胞培养板底部附着的细胞可能会对数值有一定的影响，因此建议在加入CCK-8 3－4小时后，将上清液重新吸取到另一干净的酶标板中进行读值，保证检测的准确性。
要防止反复使用同一瓶试剂后可能造成的试剂污染。

该试剂盒灵敏度较高，在细胞数较少的情况下也能区别出不同浓度药物作用后的细胞活性差别，比传统的MTT法要灵敏许多，同时，其操作比较简单，节省实验操作时间。

网友[wangzhua]：

SRB，也叫磺基罗丹明B，是在酸性条件下可特异性地与细胞内蛋白结合的染料，SRB染色后不象MTT那样很容易变色，染色后干燥的板子可以放置较长时间，而后再用Tris碱液溶解SRB，比色测定，对结果没有影响。所以，不同时间测试的板子可以同一时间测定，即使溶解后，较长时间测定也没有明显影响。

测定方法：
细胞加药培养48小时后，取出培养板，于每孔加入50ul预冷的50%三氯醋酸，静置5分钟后移入4℃冰箱中静置1小时，取出用去离子水洗5遍，空气中干燥，待完全干燥后每孔加入1%的乙酸配制的0.4%的SRB 100ul，染色20分钟后倒掉染液，用1%乙酸洗5次，去除未结合的染料。空气中干燥后用pH 10.5的10mmol/L的非缓冲Tris碱液150ul溶解，在平板振荡器上振荡5分钟，在BioRad酶标仪上测定各孔在490nm的光吸收。本底对照板的细胞同样处理测定OD490。
有关专家透露，新的抗肿瘤药指导原则中将选用此方法作为细胞毒活性测定的最佳方法。
网友[cox_1]：

最近做过些细胞活性的测定，用过MTT，也用过CCK-8：
MTT：步骤有点烦琐，中间有吸液的步骤会造成不可避免发生误差，特别是加DMOS前的一步，会吸走不少的结晶，后来改进了方法，用2%SDS-HCL溶结晶，不需要去培养基，但是必须37度过夜，耗时比较长。另外MTT反应，这一步，至少需要3小时，如果要做某个药物的急性作用，用这个方法就不太好了。
CCK-8：是MTT的改进，步骤简单，中间不需要吸出孔内的培养基，这样就减小了误差，另外CCK-8反应时间也短，最短1个小时就够了，特别适合做急性作用。缺点是有点贵。

我的疑问是：
1、不管是MTT还是CCK-8，原理基本是一样的，都是发生反应生成有色物，只不过一个是难溶于水的晶体，一个是直接溶于水的。我的问题是，如果做急性作用，是不是可以再缩短反应时间（当然OD值不能太小）？比如，缩短至半小时？另外，最后所测得OD值应该是MTT或CCK-8反应时间内细胞活性的综合反映吧？
2、平行孔的OD值，最科学的分析方法是怎样的？ 有的人把平行孔相差很大的值去掉，只保留比较接近的值，理由是：相差很大的值，很可能是操作带来的较大的误差，不可信。我个人觉得，这样做不科学，但是也找不到很好的解决办法。还希望各位给点意见。

网友[twoicedragon]：

首先感觉MTT最好现用现配，使用时避光，虽然有资料说可以长期4度存放，但觉得时间久了还是很容易出问题！另外就是最后一次加药或换液要用无血清的培养基，我的经验就是血清对结果的干扰还是很大的！还有就是做实验的复孔要尽可能的多！我的每次都要做几十个复孔才能保证实验结果！

总之自我感觉这个实验方法虽然很简单，但要出好的结果还是蛮难的！对照组一定要设置全！这个才能出了好点的结果！

网友[shuaih]：

我做过alamar blue ，MTT，台盼蓝，感觉上，台盼蓝可以分辨出死细胞，但是计数不如其他两种精确；MTT反应产物停留在细胞内，必须破坏细胞膜才能检测，可以用DMSO＋SDS＋HCL或醋酸 配置破膜溶液，效果一直很好，但是由于细胞死亡，无法进行后续检测，最多只能同时测培养基里面的物质如ALP等，所以要求很多样品数才能做完其他检测方法，还有一点就是，MTT的反应产物总是同时存在于细胞内和培养基中，这对实验结果有一定影响，造成MTT的可重复性不佳。alamar blue，则对样品数要求相对少，因为alamar blue 的产物resorufin是可溶的，可以检测培养基里面的resorufin而不必破坏细胞，但是由于resorufin是偏红色的，所以只能用无酚红培养基，对培养的时间要求也相对MTT来说要苛刻，还有一点就是alamar blue的花费也较高。

网友[dabao]：

我以前曾参与研究开发一种天然来源的免疫抑制剂。该物质被证明主要是由多肽类物质组成。我们以3H-TdR参入法测定免疫抑制剂对PHA诱导的人外周血淋巴细胞（PBL）转化的影响，组分活性以对PHA诱导的人PBL转化的抑制率表示。

具体步骤是：

将待测样品用RPMI-1640培养液稀释成一定浓度。以无菌手续采集3人份静脉血，每1ml加10u的肝素钠抗凝。取24孔培养板，向每孔内加人外周血0.1ml，对于每个人的血样做3个重复孔。向每孔内加入含10%小牛血清的RPMI-1640培养液1ml、PHA应用液0.1ml。试验孔加样品液0.1ml，对照孔加RPMI-1640培养液0.1ml，加盖后在CO2培养箱中于5% CO2、37度条件下培养48h，加入浓度为3.7×105Bq/ml （10uCi/ml）的3H-TdR 0.1ml，混匀后继续培养24h，用49#玻璃纤维膜收集淋巴细胞，用液体闪烁计数器计数每分钟的闪烁次数（cpm）。将每个人3个重复试验孔cpm的平均值作为试验样品作用于该人血样后的cpm值，按下式分别计算样品对PHA诱导的每个人PBL转化的抑制率：
抑制率（%）=（1－实验组cpm/对照组cpm）×100%
以3个人血样抑制率的平均值作为样品的活性。

该试验重现性很好，结果也较为可靠。
但是个人感受是“都快怕了”做这个试验了。首先是放射性，莫名；然后是细胞试验本身（细胞是人源原代，本人当然首当其冲是第一个志愿者；原代培养本身也有点），当然，这与该测定细胞活力方法本身无关；再次是时间较长；还有在自己单位不能独立完成，需要很多特殊设备。

网友[楚布衣]：

对细胞增殖实验来说，MTT、CCK-8和3H-TdR 我都做过。感觉是前者便宜、步骤烦琐、对实验技能要求大，否则误差较大、敏感度在三者中最低。CCK-8稍贵一点、步骤简单、稳定性不错、敏感度介于两者之间。3H-TdR 敏感性最好、但步骤较多、需要特殊设备，最大的问题是有放射线。 所以综合评价，我们觉得CCK-8简单、稳定、敏感性好、安全、价钱还能接受，所以现在细胞增殖实验主要用CCK-8来做，敏感性要求特别高的就用3H-TdR （没有小孩的、女性的一般还是避免用3H-TdR ），而MTT主要用来做学生实验。

网友[lillyjin]：

我的实验用过台盼蓝染色、MTT、CCK-8。我分离的是病人的淋巴细胞，经不同浓度的药物处理后，检测细胞增殖变化，台盼兰染色可以发现药物抑制细胞增殖是因为药物作用还是浓度大引起的毒性反应。可以发现较大的浓度药物经台盼兰染色后活细胞比例低。大部分文献对淋巴细胞增殖测定方法，用的是3H-TdR。我们实验室的这种仪器坏了，我查阅做淋巴细胞也有人用过MTT法，所以一开始我用MTT算是一个预实验，测定细胞增殖能力如下：培养的淋巴细胞浓度为1×106/ml、200μl/孔加入平底96孔板，设三个复孔，再加浓度为5mg/ml的MTT，25μl/孔，CO2下孵育4小时；1500r/min离心后轻轻吸出150μl/孔上清，再加入150μl/孔的二甲基亚砜，静置10分钟后在酶联检测仪上（570nm）测定吸光度（A，曾称光密度OD）；用每组三个复孔A值的平均值来比较，A值高，则增殖快。但是结果不理想，可能淋巴细胞为悬浮生长，MTT中间环节多，容易吸出细胞，结果不稳定．后来看过CCK－8的资料，就试着用用，跟MTT相比，步骤简单，省时省力，缺点当然是比MTT贵多了。每次的结果稍有不同，统计学还是有意义的，主要经验体会是：细胞量要够大。至少每孔保证105的量，其次要充分混匀，最好在摇床上摇荡几分钟．孵育时间要摸索，淋巴细胞在48小时的结果最好。

网友[ichi_only]：

XTT法
XTT{2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulphenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide}是MTT的一种衍生物，可被活细胞线粒体的脱氢酶还原产生水溶非细胞毒性的Formazan产物而显色，显色程度与活细胞数成正相关。主要优点是反应产物为水溶性，对贴壁和悬浮生长的细胞均适用，检测时间缩短和处理步骤减少，但本底较高，重复性受pH的影响，其它与MTT法相同。

此外还有MTS法
MTS[3-(4,5-diethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-etrazolium,inner salt]为新一代四氮唑蓝盐化合物，其被还原形成的Formazan产物水溶性和稳定性更高，显色更快。

网友[fird]：

其实直接计数法也是一种非常好的方法，至少比MTT来得准确。

首先在10cm的Dish中接种1000-10000个细胞，然后培养1周至2周，消化后，进行计数。此法简单易操作，也非常公认，主要是依靠时间来放大不同处理组的差异，原理与clone formation assay 差不多。

此外，BrdU掺入法也是不错的检测细胞增殖的好方法，原理3H放射性同位素掺入法一样，但可以不接触同位素，用荧光显微镜或FACS即可检测。

网友[mjpl04]：

H3掺入试验、MTT比色法、XTT比色法都属于测定淋巴细胞体外增殖反应的方法吧。我最近也要做关于这方面的实验，就把师兄介绍的测细胞增殖反应时应注意的问题说一下吧：
1、丝裂原的质量和活性是测定淋巴细胞增殖反应的关键因素。因此在实验前，应确定其最佳刺激量。
2、检测T细胞增殖反应，丝裂原用PHA或ConA；B细胞增殖反应用LPS或SPA；T、B细胞增殖反应用PWM。
3、增殖反应的细胞应保持高活性，一般应〉=95%。应用单抗分离制备的反应细胞因保存剂（如NaN3）或抗体的直接作用可抑制细胞的增殖。此外，增殖细胞的浓度过高或过低均不利于细胞生长。
4、细胞培养液应无菌、无支原体污染，特别是小牛血清加热灭活补体，避免LPS或其他能促进细胞增殖物的污染。因此，实验前应选择本底低的小牛血清。用人“AB”型血清或自体血清也应加热灭火补体。
网友[along911811]：

做细胞毒性加药设计和操作一直觉得是个可大可小的问题 ，估计结果重复性差可能有这方面的原因，总结一点自己的惯用手法：
1、首先用培养基将细胞毒性药物（待测药物）5倍，系列稀释，共制备8个浓度。选择浓度时应以最高浓度下多数细胞被杀死，而最低浓度下不会杀死细胞为标准，只要对药物的毒性有所了解，便可采用较小的浓度范围。一般情况下，我每种药物使用三块培养板，这样一次试验中可以有三个平行测定结果。
2、对于贴壁生长的细胞，去除第2-11列个孔中的培养基，这样可以通过将注射器针连在吸引管上来完成。
3、在第2列和第11列共8个孔中，加入200ul新鲜配置的培养基，这些细胞作为对照。
4、在第3-10列的细胞中加入细胞毒性药物，每个药物浓度仅需4个孔，这样A-D 用于一种药物，E-H用于另一种药物。
5、将药物溶液向每组的4个孔中各加入200ul。
6、温育。

网友[kenthern333]：

MTT法测定样品的生物活性，我也曾经做过不少实验。
前期的细胞铺板，样品处理都是很常规的实验室操作。
染色阶段：我们一般是 将MTT用细胞培养液（1640或DMEM）稀释成5%的溶液，过滤除菌，于96孔板中加入10-20ul/孔，再于孵箱中放置4-6hr。
溶解： 可以使用10%SDS或者DMSO。
10%SDS可以直接加入96孔板50-100ul/孔（依据不同实验来确定），再在孵箱中放置过夜，并于酶标仪上在一定波长（570nm左右）下读数。 该96孔板在随后的2-3天内的读数不会有太大的变化。
使用DMSO时，一般需要将96孔板中的上清夜除去，然后加入100-200ul/孔的DMSO。静置20-30mins，于酶标仪上在一定波长（570nm左右）下读数。
DMSO的优点是：仅仅需要30分钟就可以读取数据，实验时间大大缩短。
DMSO的缺点是： 加入DMSO时，先要除去96孔板内的上清夜， 可能会造成细胞的损失，给实验结果带来不必要的误差。

网友[myowneye6788]：

酸性磷酸酶（Acid phosphotase assay）
原理是这样的：
将一种底物（硝基苯磷酸盐）与细胞一起孵育（就是加到96孔板的孔里），细胞溶酶体里面的酸性磷酸酶将底物水解生成另外一种可以显色的物质，用酶标仪在405nm处测量就可以。显色程度反映了细胞里酸性磷酸酶的活性，进而反映了细胞的活力。
这个方法大约十年前外国人发现的，同H3掺入以及MTT也作了比较，提示完全可以代替。而且非常干净。而且很便宜，只需要买底物就可以（5g大约400元 Fluka）。

网友[MichaelHLee]：

我用的是WST－1法。理论上，WST－1法显色原理与MTT法相似，但是WST－1是水溶性的，MTT是脂溶性的，因此WST－1法比MTT法处理过程要简便，受影响因素少，只需将种好板的细胞的培养基从孔板中弃去，然后加上200微升PBS和20微升WST－1溶液（自己配制的，用PMS和WST－1按一定比例加PBS涡旋混合后，在－4摄氏度保存，避光。），同时加上空白对照。置二氧化碳孵箱中约3小时后，直接在酶标仪下测定OD值，450nm/650（690）nm，然后将值减去空白对照后，对比差值即可。

网友[luopeng]：

MTT法作了很多细胞，感觉对于贴壁细胞效果好，对于悬浮细胞，因要吸弃培养液，很容易造成formazan流失，因而导致实验结果偏差。SRB是一种活性蛋白染料，能与细胞蛋白的碱性氨基酸结合而显色，在490nm~520nm波长处其OD值与活细胞数成良好的直线关系。SRB法已被NCI选定作为筛选抗癌药物的新方法，相对于结晶紫法或目前普遍采用的MTT法，其灵敏度好于结晶紫法，相当或优于MTT法。

除此之外SRB法还有以下优点：　
1、操作时间短，细胞固定和染色仅需90分钟左右，而MTT加样后还需培养4小时。
2、没有严格时间限制，在TCA固定后或SRB结合后的细胞均可存放，Monks指出样品保存7天，测定的OD值下降不超过2％。
3、可以测定悬浮细胞，采用16% 的三氯乙酸直接加入培养细胞中能完整酸化固定细胞，较之MTT法或结晶紫法离心取上清的操作，不会带来细胞损失，测定结果更准确。因此选用SRB法对于测定不易贴壁的PC12细胞存活率，结果更灵敏准确，重复性更好。

建议大家可以试一下SRB法，SRB价格也便宜。

网友[moldir]：

我最近也在做MTT，确实很不稳定，组间差异就很大。前面大家已经说了很多了，我觉得还应注意的是：
1、培养基中酚红、人血清蛋白、免疫球蛋白、小牛血清、胎牛血清或马血清和某些添加剂可使OD值增高，影响结果。因此这类物质在进行MTT时应先洗去。
2、加入DMSO后应及时检测，OD值受作用时间的影响较大，颜色会随时间变深。
3、接种细胞数要合适。在应用一种新细胞株时，首先要知道该细胞株的细胞倍增时间，而在应用非分裂的原代细胞（如神经元或肝细胞培养）时，首先要知道该细胞在培养过程中细胞丢失的数量。根据这些信息选择合适的接种细胞数量。在MTT法进行时，96孔板中每孔的细胞数量宜控制在5×102～5×104范围。
4、每孔内各区的细胞生长不均匀可直接影响实验结果。当加药液或换营养液时，药液或营养液沿孔边缓慢加入，但不能直接加在细胞上。细胞培养的每一步操作时尽量避免产生细胞生长不均匀的各种因素。

网友[zoumiejie]：

前面有位前辈提到PI染色检测细胞活性，我也是做细胞培养测药物作用后细胞活性的，前一段时间在网上查到一点PI方面的资料，希望有帮助。
流式细胞仪检测细胞凋亡——Heochst 33342/PI双染色法
来源：生命经纬

基本原理
经固定的凋亡细胞其染色体荧光染料的DNA可染性性下降。细胞一经固定就不再是活细胞，而且细胞固定过程对细胞膜的通透性也有影响。因此发展了用“细胞活性”鉴定染料染色的流式细胞仪检测方法。这些方法细胞不经固定就直接用DNA染料染色，且染料的浓度要比固定细胞所用的浓度要低得多。流式细胞仪通常根据细胞膜完整性将细胞分为“活细胞”和“死细胞”，因此正常细胞和凋亡细胞归为活细胞。活细胞染料如Hoechst 33342能少许进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高，Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度增高的机制与凋亡细胞膜通透性发生改变有关，凋亡细胞早期细胞膜的完整性没有明显性改变，但细胞膜的通透性已有增强，因此进入凋亡细胞中的Hoechst 33342比正常细胞的多。此外，还与凋亡细胞的染色体DNA的结构发生了改变从而使该染料能更有效地与DNA结合以及凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst 33342排出到细胞外使之在细胞内积累增加等有关。既然Hoechst 33342进入凋亡细胞中比正常细胞更容易，而EB、PI或7-AAD等染料是不能进入细胞膜完整的活细胞中，即正常细胞和凋亡细胞在不经固定的情况下对这些染料是拒染，坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损，可被这些染料染色。根据这些特性，用Hoechst 33342结合PI或EB等染料对凋亡细胞进行双染色，就可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。在双变量流式细胞仪的散点图上，这三群细胞表现分别为：正常细胞为低蓝色/低红色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡细胞为高蓝色/低红色（Hoechst 33342++/PI+），坏死细胞为低蓝色/高红色（Hoechst 33342+/PI++）。

试剂与仪器
? Heochst 33342 染液：用PBS配成10ug/ml的储存液浓度，4℃避光保存；
? PI染液 ：用PBS配成5ug/ml浓度，4℃避光保存。
? 400目的筛网
? 流式细胞仪

实验步骤
1、悬浮生长的细胞在培养的状态下加入Heochst 33342 ，终浓度为1ug/ml； 37℃孵育7—10min。
2、低温500 ～1000r/min离心5min弃去染液。
3、加入1.0ml PI染液，4℃避光染色15min。
4、400目的筛网过滤1次。
5、流式细胞仪分析：Heochst 33342用氪激光激发的紫外线荧光，激发光波波长为352nm，发射光波波长为400 ～500nm，产生兰色荧光；PI用氩离子激光激发荧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光。分析兰色荧光对红色荧光的散点图或地形图。
6、结果判断：在兰色荧光对红色荧光的散点图上，结果为：正常细胞为低蓝光/低红光，凋亡细胞为高蓝光/低红光，坏死细胞为低蓝光/高红光。

注意事项
1、在红色荧光对兰色荧光散点图上，还可见到细胞凋亡区向细胞坏死区迁移的轨迹，可能是凋亡细胞的DNA进一步降解的缘故。
2、用Heochst 33342染料与细胞孵育的时间不宜过长，一般控制在20min之内为宜。如果太长可引起Heochst 33342的发射光谱由蓝光向红光的迁移，导致红色荧光与兰色荧光的比例改变，从而影响结果的判断。
友[awei]：

ATP含量测定，目前已经被大家接受为一种细胞活力检测指标，国外的相关文献已经有不少，我也是从文献知道的。目前国外已经有几家公司专门卖这种试剂盒了，国内也有，好象是壁云天公司。其原理是荧光素酶与荧光素反应时需要ATP，当用饱和浓度的荧光素酶和荧光素反应是，其发光量于ATP之间是存在定量关系的，具体来讲是它们的LOG值呈线性相关，这样就可以通过荧光值得到ATP的含量了。一般来讲，样品中的ATP量是不大的，因此一般情况下是不需要荧光素酶的饱和剂量，这样太浪费试剂，但个别情况下ATP含量奇高，就需要这样作了。我做过几次，实验的可重复性明显好于MTT。在作MTT时由于它的变异度较大，不得不加大样本量，但ATP含量测定其稳定性较好，样本量一般不需要很大，我一般每一个分组有四，五个样品足够了。

网友[jjw703]：

1、台盼蓝染色法，对于悬浮细胞来说，还比较方便，对贴壁细胞来说，较为繁琐。因为要消化，有时，96孔板不一定能消化干净。而且，该法是测定细胞浓度的方法，与细胞悬液的体积有关，加入的胰蛋白酶或1640要计入终体积。可以说，该法相对准确，可能有一些人为因素的干扰。
2、克隆（集落）形成法，对贴壁细胞来说，较为方便，也较客观。但要注意（1）一定要将细胞充分分散，边摇边加入孔板中；（2）用枪加到孔板时，用力柔和，避免细胞冲到孔板的壁而沉下，导致细胞克隆在孔板的四周较多，中间较少，细胞克隆集中于四周，导致计数误差。
3、MTT法，测定的是细胞浓度，要注意细胞悬液的体积。血清蛋白对实验测定有干扰，要弃上清，加入一定量的SDS或DMSO溶解沉淀物，这两步都会给实验带来误差。而且在96孔上操作，实验孔较多时，加样次数越少越好。所以，该法如斑竹所说，会有误差。
4、CCK－8的实验，只加样一次，实验比MTT法简单，比台盼蓝染色法客观，它的缺点有两方面：
（1）比较贵；
（2）加入CCK8试剂后，一般要放入CO2箱1-2.5小时，保温时间越长，测定A值越高，虽然每一孔的A值都增加了，但不同的孵育时间，测定的IC50还是不同的，但IC50改变不大。

本来细胞浓度测定，测定的细胞浓度是相对值，无论台盼蓝染色法，MTT法，CCK8法都是相对准确的实验，在此意义上，CCK8可以说是比较方便，准确，客观的方法。我们小组的经验是
1、酚红的颜色可能影响实验结果（都是橙黄色），若实验的试剂空白组A大于0.2，则实验体系用无酚红的1640（有售），否则，则不怕/忽略酚红的影响。
2、每次实验，不同孵育时间，A值不一样，以“细胞对照组A＝1.0左右”为最佳孵育时间，每次实验与此统一。

网友[jiyi923]：

给大家介绍一种测定细胞活性的方法，大家可以自己跟MTT比较一下。

原理：Sulforhodamine B （SR）是一种蛋白质结合染料，粉红色，可溶于水。SRB可与生物大分子中的碱性氨基酸结合，其在515nm的OD读数与细胞数呈良好的线形关系，故可用做细胞数的定量。

材料与方法：
1、其细胞接种与MTT相同。
2、SRB用1%醋酸配成0.4%溶液。细胞在加药培养结束后用三氯醋酸（TCA）固定：贴壁细胞每个小孔加预冷的50%TCA液50ul（终浓度为10%）固定；悬浮细胞每孔加预冷的80%TCA50ul固定，加TCA时必须轻轻加在培养液表面，静置5分钟后再将平板移至4度放置1小时，这样可使悬浮细胞固定在培养孔的底部。
3、倒掉固定液，小孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。
4、每孔加如100ulSRB液，在室温放置10分钟。未与蛋白结合的SRB用1%醋酸液洗5遍，空气干燥。
5、结合的SRB用150ul 10mmol/l非缓冲Tris碱液（ph10.5）溶解。
6、用自动化分光光度平板读数计在515nm波长处测定每个小孔的OD值。

本法用TCA固定细胞后，可随时用SRB作蛋白含量测定，不受测定时间的影响。SRB用tris溶解后也可稳定一个较长的时期。OD与SRB浓度作图时，在OD 单位1.5-2.0间为线性，当超出线形范围时，必须稀释后重新读数。

MTT操作过程中必须吸出细胞培养的上清液，使之比较费时及增加可能的误差，大量使用DMSO也不受欢迎。此外，OD值随时间变化也是一个较大的缺点。当然SRB法操作比MTT复杂一点，但是时间可以自己掌握，不受测试时间的限制。

网友[CindyGloria]：

Trypan Blue 台盼蓝排斥试验，比较适合原代培养的细胞。

原理：
细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与活细胞。还有其他燃料，如伊红Y和苯胺黑等。

用品：
1. 4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时。用PBS稀释至0.4%。
2. 吸管、血细胞计数板、显微镜

步骤：
1、制备单细胞悬液。并作适当稀释（10 *6 细胞/ml）
2、染色：取9滴细胞悬液移入小试管中，加1滴0.4%台盼蓝溶液，混匀。
3、计数：在三分钟内，用计数板分别计数活细胞和死细胞

结果：
镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。
根据下式求细胞活力：
活细胞率（%）= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）*100

注意事项：台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。

台盼蓝主要用来鉴定原代培养细胞时，细胞分离后的存活情况，用0.4%台盼蓝直接染色，在显微镜下观察即可，活细胞不被染色。方便易用，因此在实验室中比较常用，尤其在心肌细胞原代培养中。

网友[lalala_2004]：

台盼兰染色法价格低廉，操作简单，又不用无菌操作，做这个实验只要是把显微镜调好了，细胞浓度调好了就不会有问题，是一个养细胞的入门实验，所以很适合初学者做。我做这个实验主要是用来确定抑制细胞增殖的药物浓度，排除浓度过大引起的毒性反应。

MTT性价比最高，操作上也不复杂但是也要注意一些地方：
1、刚开始做MTT 实验的时候，结果的稳定性及重复性不好，后来查资料发现，MTT实验的最后OD值要控制在0.75－－1.25之间，这样才能保证数据有线性关系。在先控制好了合适的培养时间和细胞数后，所得到的数据还是令人满意的。
2、一定要保证每孔细胞数相同，这一点很重要，所以一定要充分混匀，边加边吹打，尽快加完。
3、尽量用新的96孔板，同时加样时注意准确，吸弃上清时，尽量小心，不要吸起沉淀，以减小误差。
4、血清浓度对MTT实验也有影响，尽量不高于5％，因为如果蛋白质含量高了，加入MTT反应后会有蛋白沉淀出现，最后的沉淀很难溶。
5、MTT试剂一定要注意避光，如果变绿了，就绝不能用了。

网友[细雨纷飞]：

改良MTT法在细胞活性测定中的应用：
原来的MTT法操作起来比较烦琐，要求技术熟练，但是结果的重复性比较差，因此我们在细胞增殖试验中采用了改良的MTT法，具体步骤如下：
1、细胞接种（96孔板），每孔100μl，细胞量2～5×104个（细胞数量将决定加入裂解液之后的孵育时间）。
2、根据聚体要求进行处理，处理物的量一般为10μl。
3、处理完之后直接加入10μlMTT，继续培养4小时。
4、直接加入裂解液100μl，裂解的时间由接种的细胞量决定，2～5×104个细胞，4小时可充分裂解，如果细胞数目比较大，就要延长孵育的时间。
（裂解液的配比：100ml的N,N-二甲基甲酰胺，100ml蒸馏水，30gSDS（十二烷基硫酸钠）；搅拌待SDS充分溶解之后过滤，过滤得到的液体即可直接应用）
5、裂解完毕之后在振荡器上振荡10min，酶标仪测定。

本方法的方便之处是不要反复吸出液体，减少了操作不当影响结果，每次操作只要直接加入液体就可以了，但是加入的量要按上述说过的量，要不就会溢出孔外，重点是裂解液的配比。

如果要了解的更加聚体，可以参考“改良MTT法检测HEPG-2细胞的增殖”，发表在今年6月份这一期的《卫生毒理学杂志》。
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2楼2007-09-30 21:59:45
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yxfeng

金虫 (小有名气)

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Good. Thanks!
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3楼2007-10-15 21:39:08
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baiyajun_2

银虫 (初入文坛)

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good,thanks.
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4楼2008-09-17 15:22:36
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