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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » WB，使用myc标签抗体出现很多杂带
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sakura01_22

木虫 (小有名气)

[求助] WB，使用myc标签抗体出现很多杂带

构建了一个带myc标签的蛋白，转染MCF-7细胞，设置了空白组，和6个实验组（没有空载，因为质粒量不够），用CST myc-tag一抗孵育2h，结果出现很多杂带，本来只有一条带的。师姐用这个抗体特异性还挺高的，但我做就是做不出来，求教原因和解答。

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心怀希望，放飞梦想！
1楼 2013-05-10 11:17:36
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sakura01_22

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lubuddy at 2013-05-10 21:08:29
本来只有一条带是什么意思？你用的这个细胞株没有内源Myc表达么？你使用的细胞株和你师姐的一样吗？

单纯从western上避免杂带就是延长封闭时间，一抗孵育在4度下进行，同时一抗稀释液含tween。如果不是western的 ...

应该没有吧，查过文献，细胞株和师姐用的不一样，所以我打算用师姐的细胞做个对照，看是不是我操作或配制一抗有问题，一抗稀释液含有吐温，拿TBST配的。确实可以做IP，但是做IP费钱……想先做个WB鉴定一下表达情况~
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心怀希望，放飞梦想！
3楼2013-05-11 21:47:00
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lubuddy

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+2, 鼓励应助 2013-05-11 18:55:04
本来只有一条带是什么意思？你用的这个细胞株没有内源Myc表达么？你使用的细胞株和你师姐的一样吗？

单纯从western上避免杂带就是延长封闭时间，一抗孵育在4度下进行，同时一抗稀释液含tween。如果不是western的问题，那可能是蛋白降解导致多条带或者转染表达存在问题，使表达出来的蛋白都带myc但是大小不一。我记得CST的myc应该可以做IP，你可以IP纯化一下再看看有没有杂带
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2楼2013-05-10 21:08:29
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