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H-xiangzhu金虫 (正式写手)
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引物设计
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| 基于primer premier 5.0 进行引物设计，但是出来后发现序列太短，不知道是不是保守序列选择不当，请问虫友怎么选定的保守序列？用什么方法设计出来的序列可以长点呢?期待虫虫的回复，谢谢~~ |
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dafeizizhu
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H-xiangzhu(gyesang代发): 金币+2, 热心的虫子，详尽的解答！ 2013-05-02 12:15:23
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| 我不知道你要扩增什么，是RACE PCR还是其他的什么。我这里给你两个实例，你看看对你有没有帮助。第一，我的一个同学做的mtDNA扩增的，她的情况是知道要扩增片段两端的序列，中间的序列是目的片段，但是大小与序列都是不可知的，这时设计引物，就在两端设计，至于能扩增出多少bp的片段，不可知。多少bp都是有用的。第二，我的另一个同学，他是做RACE的，保守区设计引物需要简并引物，这时需要很多对，至于大小，就根据你使用Primer 5了，想要多少就能多少。所以，你能告诉我你做什么的，大致啊，我就可以帮帮你，尽我所能吧。 |
2楼2013-05-02 10:11:09
H-xiangzhu
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3楼2013-05-02 21:11:13
dafeizizhu
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H-xiangzhu(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-04 19:34:27
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primer 5 是可以手动收索引物对的，可以先固定一端，然后再找另一端。找到之后可以看看评分，什么二聚体，发夹结构，错配等。如果这样设计引物，有一点是不太好的，就是可能找不到最理想的引物对，可能下面的几个按钮总有一个或几个是红色的。这时，就得看看什么条件最影响实验，个人建议以错配最少为好。适量允许发夹结构和二聚体的存在，因为这两个方面的问题可以通过提高退火温度来解决。你的情况和我同学扩增mtDNA上D-loop一样的。还有，要找一对引物适合多种物种，建议你先比对这些物种保守区有没有共同序列，虽说是保守区，但也或多或少有些区别的。要找到共同序列就好说了。 |
4楼2013-05-04 08:11:24