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sd3824289

木虫 (正式写手)

[求助] 求助：我用pET32a载体做外援表达，表达菌是BL21(de3)，诱导后怎么没有特异性条带？

求助：我用pET32a载体做外援表达，表达菌是BL21(de3)，诱导后怎么没有特异性条带？ 恳请各位虫友们给点意见啊！谢谢了！   急！！！
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坚持，就像流星，即使知道最后的结果，也要勇敢的走到最后！
1楼 2013-04-26 18:33:21
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回帖置顶 ( 共有1个 )

乐乐3952

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
sd3824289: 金币+2, 博学EPI+1, ★★★很有帮助 2013-04-26 21:00:54
首先检验下载体没出错，其次就是表达诱导条件，换下低温诱导（或是30°诱导），适量增加诱导剂计量看看，祝好运
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一花一世界、一叶一菩提
2楼2013-04-26 19:17:56
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普通回帖

sd3824289

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 乐乐3952 at 2013-04-26 19:17:56
首先检验下载体没出错，其次就是表达诱导条件，换下低温诱导（或是30°诱导），适量增加诱导剂计量看看，祝好运

载体应该没有问题，我诱导的温度是18℃。但是还是没有特异性条带，是不是和蛋白自身的性质有关？如果这个是膜蛋白的话，是不是还得用专门的膜蛋白载体和受体菌来表达？
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坚持，就像流星，即使知道最后的结果，也要勇敢的走到最后！
3楼2013-04-26 20:55:26
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sd3824289

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 乐乐3952 at 2013-04-26 19:17:56
首先检验下载体没出错，其次就是表达诱导条件，换下低温诱导（或是30°诱导），适量增加诱导剂计量看看，祝好运

非常感谢你的建议！
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坚持，就像流星，即使知道最后的结果，也要勇敢的走到最后！
4楼2013-04-26 20:55:42
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alicelchf

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by sd3824289 at 2013-04-26 20:55:26
载体应该没有问题，我诱导的温度是18℃。但是还是没有特异性条带，是不是和蛋白自身的性质有关？如果这个是膜蛋白的话，是不是还得用专门的膜蛋白载体和受体菌来表达？...

你的IPTG诱导条件是什么呢？浓度？
你是从保菌开始摇菌诱导的吗？还是从质粒转化BL21，单克隆开始摇菌？
另外，你的温度不需要提前进行优化，可以尝试37度常用条件进行，先确定表达蛋白，再想着优化各种条件。
膜蛋白没有一定特殊的菌种
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修身、齐家、治国、平天下
5楼2013-04-26 21:08:21
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乐乐3952

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by sd3824289 at 2013-04-26 20:55:26
载体应该没有问题，我诱导的温度是18℃。但是还是没有特异性条带，是不是和蛋白自身的性质有关？如果这个是膜蛋白的话，是不是还得用专门的膜蛋白载体和受体菌来表达？...

特异性条带是指跑SDS PAGE电泳时没看到目的条带很明显，还是在你通过镍柱纯化后（加了his标签的话）没有目的条带？如果你的蛋白能通过什么方法检测下就好了；膜蛋白的话没做过相关的内容，可以在小木虫搜索下看看
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一花一世界、一叶一菩提
6楼2013-04-28 16:10:49
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