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foresrer

新虫 (初入文坛)

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专业: 森林培育学

[交流] 过氧化物酶测定为什么不显色呢，我用的是愈创木酚法已有11人参与

过氧化物酶测定，为什么不显色呢，马上毕业了，急着写毕业论文呢，可是实验还没做，呜呜

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1楼 2013-04-22 19:31:19

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凌浩

金虫 (正式写手)

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专业: 作物栽培与耕作学

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过氧化物酶在测定过程中的要求是比较严格的，根据实验原理可以知道，双氧水跟愈创木酚反应生成茶褐色产物，如果是测定过程出现问题了，只会有两种可能：一，加入的双氧水挥发完了。二。没有酶活。而对于这两种可能的原因有如下几条：反应液配置的时候愈创木酚难溶需要加热（愈创木酚没有溶）；加热后要冷却室温，防止加入的双氧水挥发（双氧水挥发完了）等等。下面提供详细的POD测定过程，仅供参考
愈创木酚过氧化物酶（POD）活性的测定----愈创木酚法
【实验原理】
　　　在过氧化物酶催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470nm处有最大光吸收，故可通过测470nm下吸光值变化测定过氧化物酶活性。
【仪器、材料与试剂】
（一）仪器
　　　1. 分光光度计　2. 台式离心机
（二）材料
　　　1. 磷酸氢二钠 2. 磷酸二氢钠
　　　3. 2-甲氧基酚　4. 30％H2O2
　　　5. 陶瓷小研钵　6. 2ml 离心管
（三）试剂
　　　1.  0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)：
　　　A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；
　　　B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)的配制：分别取A母液(Na2HPO4 )12.3ml和B母液(NaH2PO4 ) 87.7ml混匀即为100ml PBS(0.2M，pH6.0)；
【实验步骤】
　　　1. 酶液提取
　　　称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml （0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清夜即为酶粗提液。
　　　2. 酶活性测定
　　（1）反应混合液的配制：取50mlPBS（pH6.0，0.2M）缓冲液于烧杯中，加入28μl愈创木酚（2-甲氧基酚）于磁力搅拌器上加热搅拌，直至溶解愈创木酚溶解，待溶液冷却后加入19μl 30％的H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。
　（2）酶活性测定：取3ml反应液并加入40μl酶液后测定OD470值在40秒的变化。以PBS代替酶液为对照调零，
　　　3. 计算结果
　　　以每min OD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。，按下式计算活性
　　　POD活性=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t） (u/g FW)
ΔA470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml）。
【注意事项】
　　　1.  反应液配制时由于愈创木酚难溶，应加热一段时间。加入H2O2前注意溶液冷却，防止H2O2的挥发。
　　　2.  由于该反应迅速，加入酶液要立即进行吸光值的测定。
参考文献
J.L. Muñoz-Muñoz, F. García-Molina, P.A. García-Ruiz, E. Arribas, J. Tudela, F. García-Cánovas, J.N. Rodríguez-López, Enzymatic and chemical oxidation of trihydroxylated phenols, Food Chemistry, Volume 113, Issue 2, 15 March 2009, Pages 435-444
F. Quintanilla-Guerrero, M.A. Duarte-Vázquez, B.E. García-Almendarez, R. Tinoco, R. Vazquez-Duhalt, C. Regalado, Polyethylene glycol improves phenol removal by immobilized turnip peroxidase,Bioresource Technology, Volume 99, Issue 18, December 2008, Pages 8605-8611