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forrestgump新虫 (著名写手)
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能否抑制某一特地蛋白，基因敲除方法除外。
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各位老师： 最近准备开题了，我们老板发现了一个蛋白在血液含量特别高，就会的高血压病，现在让我做这项研究，可是我是刚入门看的文献特别少？我想请问有没有专门针对某一种蛋白设计的可以抑制这种蛋白的功能的技术？记得以前有人说过PNA的可以实现这个功能，请大仙们踊跃解答，不胜感谢！ |
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starseacow
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4楼2013-04-18 05:00:14
凌波丽
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【答案】应助回帖
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forrestgump: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2013-04-18 16:02:29
silicare: 金币+10, MolEPI+1, 应助指数+1, 辛苦了 2014-02-19 10:55:54
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silicare: 金币+10, MolEPI+1, 应助指数+1, 辛苦了 2014-02-19 10:55:54
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刚要下线，看到你这贴，就说几句了。 能否抑制某一特地蛋白，基因敲除方法除外，当然knock in也就不说了，本质一样。siRNA,miRNA引起的基因沉默，有成型的protocols。siRNA可以通过降解mRNA和引起DNA的甲基化（招来一些DNA甲基化酶），还可以引起染色质大片段的异染色质化导致基因沉默。miRNA一般是在mRNA的5’末端，有时也在mRNA的3’末端形成空间位阻导致基因沉默。当然siRNA,miRNA引起的基因沉默，肯定不是100%。另外还可以通过对于蛋白质的结构改变而使得其功能丧失，最常用的一个办法，利用目的蛋白免疫小鼠后获得单抗（具体实验步骤省略），然后用显微注射入细胞类让其与目的蛋白质发生免疫反应，抑制目的蛋白质的功能。还有：通过对目的蛋白质加以点突变，改变其折叠状态，以影响其生物功能。 下面举个例子，是我回答别人的一个具体的实验课题（研究某蛋白质的功能）的全程设计，可以参考。 动物细胞的一种氧化还原酶在大肠杆菌中的表达 与在细胞中的定位（实验设计方案与讨论） 题目：用大肠杆菌表达来源于动物细胞的某一氧化还原酶；并利用免疫荧光技术对细胞中的该蛋白进行定位。答：这问题由我本人设计实验（方法还有很多种，我没有都写出来），但不是我的实验课题，是我在2012年的最后一天的晚上在“百度知道”（偶尔去了一趟） 回答内蒙古大学某人的一个实验设计问题，可我刚回答完，原问题就被撤消了（⊙﹏⊙b汗）。答案不是唯一的（疏漏之处欢迎斧正）。 这不难设计。 第一步，获得来源于动物细胞的某一氧化还原酶的基因并且将其导入大肠杆菌。这就是分离基因，化学合成，cDNA文库，mRNA筛选（比如DDRT，RDA，mRNA差异显示技术,削减杂交等），鸟枪法分离基因等等；然后导入载体 （质粒，用表达载体好一些，因为先把载体DNA整合到大肠杆菌的基因组不太容易，整合进去高表达还要费不少事情）；再将载体导入大肠杆菌细胞（比如氯化钙 制备感受态大肠杆菌，使其转化载体进入其细胞），一般在其基因之前加上强启动子。这步还包括阳性克隆筛选和分离，大规模培养，产品收获就算了，不要粉碎细 菌，也不要构成分泌蛋白质，就让目的基因表达的蛋白质留在大肠杆菌细胞里。这一步就是完全依据基因工程的进本步骤而设计。 第二步，获得抗来源于动物细胞的某一氧化还原酶的单克隆抗体。单抗的制备方法，最粗糙的方法：小鼠腹水法。其实用多克隆抗体也可以，只是效果差一些。 第三步，给单克隆抗体标记上可以发出荧光的基团。荧光从哪来？给偶连蛋白质标记上能够发出荧光的有机染料分子不就行了。或者也可以直接使用量子点荧光 法，量子点本身也就是靠其偶联的抗体在细胞内定位的。量子点制备与实验方法的原理与步骤可以参见Methods in Molecular Biology Vol-374-Quantum Dots。这一步也下一步密切信关，做得好下一步可以省很多事情。当然也可以给把单克隆抗体的基因偶联上绿色荧光蛋白的基因在大肠杆菌中一同表达，两者之 间共价键链接，但是比较麻烦。 第四步，将用免疫荧光基团标记的抗来源于动物细胞的某一氧化还原酶的单克隆抗体进入大肠杆菌细胞中。给把单克隆抗体的基因偶联上绿色荧光蛋白的基因在大肠杆菌中一同表达，两者之间共价键链接，首先还要要把抗一种将抗来源于动物细胞的某一氧化还原酶的单克 隆抗体的基因分离出来导入大肠杆菌这也是一种实验方法，不过构建基因，联入DNA载体，导入细胞，阳性克隆筛选，工作量可不小，我是不这样实验的，时效比 太低。还有其他的更简单的实验方法：直接从蛋白质水平动手。从外界导入带有荧光标记的抗来源于动物细胞的某一氧化还原酶的单克隆抗体蛋白质，这又可以有好多种办 法：一种显微注射法，对实验人员的操作水平要求推高，而劳动量大，像我这样的懒人绝对不干（给钱也不干）；第二种方法让细胞内吞摄入蛋白质，然后把抗来源 于动物细胞的某一氧化还原酶的单克隆抗体一起拉入细胞（去查一下大肠杆菌内吞哪些蛋白质），当然要把大肠杆菌内吞蛋白质与抗来源于动物细胞的某一氧化还原 酶的单克隆抗体共价链接在一起。怎么连？再做个融合蛋白的基因去表达出来？那多累呀，像我这样的懒人绝对不干（给钱也不干），谁像这样实验谁就去做，反正 我绝对拒绝如此实验（不当低水平劳动力），可用分子交联方法-------用有机试剂把两者用化学反应偶联到一起不就行了吗，有空间位阻，加个链接臂行了 吧，比如可以先用EDC、戊二醛等试试看，去查一下与抗体工程和酶的固定化相关的Methods inMolecular Biology ，Methods in Enzymology系列的实验手册。分子交联方法当然会出很多的混合物，用层析筛选一下，在检测一下活性，适当控制和调整反应试剂和反应条件，得到阳性 结果不难。荧光从哪来？给偶连蛋白质标记上能够发出荧光的有机染料分子不就行了。或者也可以直接使用量子点荧光法，量子点本身也就是靠其偶联的抗体在细胞 内定位的。量子点制备与实验方法的原理与步骤可以参见Methods in Molecular Biology Vol-374-Quantum Dots。第三步和第四步实际上很难说谁先谁后，我是为了说明清楚人为分开的。 第五步，单抗与来源于动物细胞的某一氧化还原酶（抗原）相互作用。抗原与抗体相互作用并不困难，但是在细胞中要注意必须使得两者在同一个亚细胞区室中。因为这题是在大肠杆菌中，没有细胞器，也就不必再给当克隆抗体连接上 进入各个封闭性的细胞器的信号肽序列，比如进入线粒体或者叶绿体或溶酶体等特异性信号肽序列。如果原问题问的是确定大肠杆菌表达的来源于动物细胞的某一氧 化还原酶在大肠杆菌的细胞的具体部位，那么这步实际上就省略了；如果原问题问的是确定大肠杆菌表达的来源于动物细胞的某一氧化还原酶在原来表达它的动物细 胞中的具体部位，那么给单抗的氨基端接上信号肽或者信号斑（后者不在氨基端）可能就是需要的（第六步再解释为什么即使对于真核的动物细胞也不是必须要给单 抗接上信号肽和信号斑）。给单抗接上信号肽和信号斑用融合蛋白当然是可行的，但是工作量又大了，有没有更爽的试验方法？当然有！请看第六步， 第六步，确定大来源于动物细胞的某一氧化还原酶在大肠杆菌的细胞和在原来表达它的动物细胞中的具体部位（原题没有说清楚，所以对两种细胞都要讨论）。 1.确定大肠杆菌表达的来源于动物细胞的某一氧化还原酶在大肠杆菌的细胞的具体部位。给予大肠杆菌细胞外界光源，使导入的荧光基团发出特异性波长的荧光， 用荧光显微镜直接观察荧光所在细胞的亚细胞部位，并拍照可确定大肠杆菌表达的来源于动物细胞的某一氧化还原酶在大肠杆菌的细胞的具体部位。 2.确定来源于动物细胞的某一氧化还原酶在原来表达它的动物细胞内的具体部位。按第五步构成融合蛋白质当然是可以的，但是等于把第一步的工作有对抗源于动 物细胞的某一氧化还原酶的基因基本上又重复了一遍，工作量大也没有太大必要。但是在氨基端共建连接上一段信号肽，用有机合成合成方法（比如用EDC催化氨 基与羧基缩水构成新的肽键，虽然副反应不少，但是反应条件温和，效率高，用层析分离收获到所需产品并不难，可是信号斑在肽段中间，再用有机合成先切开再插 入信号斑序列，然后还要连接，每一步都有副反应，每一步都要分离提纯，还涉及到重折叠，即使能够做成，劳动量比融合蛋白绝对不小。 那怎么办？既然困难很大，那么就另辟蹊径，从别的实验途径达到目的。做好了有荧光染料标记的抗来源于动物细胞的某一氧化还原酶的单克隆抗体，不再加工了； 而转向加工原来表达“来源于动物细胞的某一氧化还原酶”的动物细胞本身·， 将该种动物细胞粉碎，然后分级分离提纯细胞不同成分，比如离心、层析，不用太多的分离纯化，对膜性封闭细胞器还是必须能够彼此分开，因为要加以各自粉碎， 膜性封闭细胞器混在一起被粉碎就不知道液相提取液的具体来源了。然后分别对于不同提取液加入有荧光染料标记的抗来源于动物细胞的某一氧化还原酶的单克隆抗 体，进行免疫沉淀。发生沉淀后收集免疫沉淀物，因为可以事先用非变性分子筛层析测出单抗与目的酶混合物的相对分子量，再给予不同提取液加入有荧光染料标记 的抗来源于动物细胞的某一氧化还原酶的单克隆抗与其抗原的复合物给予外界光源，使单抗偶联的荧光染料发出特定波长的荧光，进而用荧光显微镜观测，是阳性结 果的提取液是目地酶的来源的亚细胞定位处。如果免疫沉淀物中的荧光有机染料不能够有效吸收外界光源并且激发荧光，可以适当加入中性盐溶液，比如氯化钠，拆 解开免疫复合物，并适当稀释。因为有荧光显微镜的直接观测，所以免疫沉淀可以做的稍微比较粗糙。 实际上，还有很多种实验方法，有很多实验方法不必使用免疫荧光，可能还更加简单。 Good Luck! 我只是抛砖引玉，并不是说我的上面的实验设计方案就是最好的，更不是唯一的。 提高实验设计能力，除了学习基本的实验原理和基础理论知识外，还要注意课本中的经典实验的基本设计方法，但是这是远远不够的，可能的话要看些实验指导书。 在自己有条件做实验时多动手多思考，而不是照猫画虎的临摹一遍；没有条件自己动手时可以仔细思考关键的实验总体过程，把大的问题逐渐分解为小的问题，再根 据掌握的知识去试图能够用一些实验手段对小的问题加以实验操作性的解决，并且要考虑小的问题的解决是在解答大的问题过程中起到了什么具体的作用。阅读SCI原始论文是必要的，但是没有学好基本的基础理论知识和基本的实验原理，看多少论文都是用海市蜃楼来炒作房地产，比房地产泡沫还玄虚。仅仅熟悉教 材上的经典实验设计没用！--------我没有让谁完全不去看经典实验！实验技术早就超越了教材上的经典实验的时代，不接触一些现代实验技术，没有可能 提高实验设计能力-----------无论在考试中，还是在科研工作中。 |
2楼2013-04-18 00:07:36
凌波丽
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forrestgump: 金币+1 2013-04-18 16:02:47
forrestgump: 金币+1 2013-04-18 16:02:47
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当然，通过抑制所研究的功能蛋白质的上下游的活性也可以达到抑制目的蛋白质的功能的作用。通过上面的实验的全程设计的举例，虽然不是直接与楼主的课题有关，但是有关的是研究技术是相通的。另外，基因的异位表达也是一种重要的研究基因功能的方法，比如iPS cell中应用就非常明显。调出目的蛋白质的上下游蛋白质然后对上下游者加以修饰或者抑制也是抑制目的蛋白的功能的方法。 另外，让目的蛋白质的基因多加上些序列，引起其折叠形态改变，进而引起功能或细胞定位改变也能够抑制正常功能的发挥。所由以上的各种方法，都可以先在细胞水平上实验（原核真核细胞是需要而定），也就可参考我举的例子的试验流程。呵呵。。。我上贴没有跑题。。。。  |
3楼2013-04-18 00:19:28
